第二节 子宫颈癌的HPV检测
【培训目标】
1.掌握
HPV病毒的流行病学特点和临床应用。
2.熟悉
HPV病毒的检测方法和技术。
3.了解
HPV病毒的生理特点。
4.扩展
HPV病毒感染相关生殖道疾病的临床诊断治疗。
【主要内容】
1.HPV病毒的生理特性。
2.HPV病毒的流行病学特点。
3.HPV的检测方法。
4.HPV检测在临床的应用。
5.HPV与生殖道疾病。
一、HPV的生理特性
1.人乳头瘤病毒的分子结构与功能。
●人乳头瘤病毒（HPV）属于乳头多瘤空泡病毒科、乳头瘤病毒属，是由7 800～7 900个碱基对以共价键组成含有遗传信息的闭合环状双链DNA。
●HPV病毒衣壳由72个壳粒构成，壳粒由主要衣壳L1蛋白与次要衣壳L2蛋白组成。
HPV的基因结构
2.HPV 的分型［1］
●根据生物性特征和致癌性，HPV分为高危型和低危型。
●高危型：与癌及癌前病变发生相关，又分为致癌型、很可能致癌型、可能致癌型。
● 低危型：主要与湿疣及下生殖道低度病变相关，HPV6、11型主要引起约90%的外生殖器、阴道和子宫颈的外生型尖锐湿疣。
3.HPV的感染特性
●HPV具有高度的宿主特异性和嗜上皮性，主要感染人体特异部位皮肤、黏膜的复层鳞状上皮。
●亚临床感染：病毒DNA游离于宿主的DNA之外，并不破坏宿主细胞，但可以随着细胞的复制而复制并进入子代细胞，既无临床表现，也没有异常的细胞学表现，仅HPV DNA检测阳性。
●临床感染：HPV病毒不断进行复制，使接近表层的细胞产生越来越多的病毒基因组，同时对宿主细胞产生破坏，形成“挖空细胞”，从而形成细胞学和组织学检查可见的感染征象。对他人具有感染性。
二、HPV感染的流行病学特点
1.HPV的传染途径
●性接触是主要的传染途径。
●不排除其他途径：污染物接触传播、母婴垂直传播等。
2.HPV的感染率
●约80%的性活跃妇女在一生中至少感染过一次。
●大多数的感染是一过性的，可以在1～2年内被机体清除。
●有10%～20%呈持续感染。
●HPV感染率因地区和人群而异，总的感染率为10.4%～15%，欠发达国家的感染率高于较发达国家。
3.HPV的感染型别
●感染可以是单一型别，也可多重感染；不同的地区感染型别存在一定的差异。
●全球范围的HPV感染从高到低的排序列前13位的分别是16、18、58、52、51、31、56、33、45、53、39、35、66 型。
4.不同病变程度的型别分布
●宫颈病变人群中HPV感染的型别分布与普通人群不同。
●宫颈高级别病变人群中HPV16是最常见的类型。
●宫颈病变中其他HPV型别的排序：非洲和欧洲HPV31、33，亚洲 HPV58、52，拉丁美洲和加勒比海HPV58、18，北美洲 HPV6、18，大洋洲 HPV31、18。
●来自中国的荟萃分析：LSIL和HSIL患者中的HPV型分布相似，依次是 16、58、52、18、33 和 31 型；在浸润癌中HPV16的感染率高达58.7%，其后依次是18、58、33、52 和 31 型。
5.HPV感染的高危因素
●主要因素：年龄、性行为习惯。
●其他因素：多产、口服避孕药、吸烟、合并感染其他性传播疾病（包括沙眼衣原体和HSV-2）、自身免疫缺陷、遗传因素等。
三、HPV的检测方法
●目的是用于子宫颈癌筛查，即预测子宫颈高级别病变，不是诊断是否有病毒感染。
● 检测方法：HPV DNA检测、HPV RNA检测、HPV蛋白检测、HPV感染相关的生物标志物检测等。
2017年国家食品与药品监督管理局（CFDA）颁布了《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》［2］
1.HPV DNA检测
（1）原位杂交技术：
使用克隆或合成的寡核苷酸作为探针对石蜡组织进行检测，优点是能保持细胞原来的位置和结构，可以作定位检测，特异度高，缺点是灵敏度不高，操作复杂，价格贵，临床上目前已极少应用。
（2）信号放大技术：
通过与HPV DNA结合的化学信号进行放大的方法来检测HPV。
● 第二代杂交捕获技术（hybrid captureⅡ，HC2）：采用免疫技术并通过化学发光使信号放大的检测方法，是首个获得美国FDA批准的HPV检测方法。对13种HR-HPV进行定性和半定量测定，但不分型。有较高的敏感性和特异性，但不能分型，缺乏内部质控，与低危型HPV存在交叉反应。
●Cervista HPV：基于Invader专利技术的Cleavase酶切信号放大法检测方法，可检测14种HR-HPV，分别采用A7、A9和A5/A6三组探针进行检测，不能分型。拥有内部质控，灵敏度较好，但对特异度不一致。
（3）靶标扩增技术：
●利用聚合酶链反应法将HPV的DNA或RNA进行扩增进而予以检测鉴定的方法。
●荧光定量聚合酶链反应技术采用针对某个HPV基因型的特异引物及探针扩增病毒DNA序列。Cobas 4 800属于这种方法，与HC2有着相似的敏感性和特异性。
●普通PCR+芯片杂交的方法也是常用的检测方法，可用于HPV的分型检测。
●PCR结合新一代测序技术的分型检测方法。
2.HPV RNA检测
●Aptima HPV检测：检测E6/E7 mRNA，在理论上比HPV DNA检测能更精确发现具有临床重要性的感染。
●与4种HPV DNA初筛相比，Aptima HPV初筛的敏感性不变，但特异性更高；降低了对一过性感染的检出率。
●E6/E7 mRNA阴性的CIN2+和CIN3+的3年累计绝对风险值与DNA检测相似，阳性的累计绝对风险值更高，提示E6/E7 mRNA初筛具有相似的阴性预测值和更高的阳性预测值。
3.HPV蛋白检测
●用宫颈脱落细胞在蛋白水平对HPV进行检测的方法。
●OncoE6检测 HPV16、18和（或）45型别的E6蛋白的表达，初步的研究表明与用HPV DNA检测相比较，对CIN3+的检出具有更好的特异性，但敏感性降低。OncoE6有可能被用于HPV阳性妇女的分流。
●该检测技术对实验室设备要求低，可在资源相对匮乏地区使用。
4.HPV感染相关的生物标志物检测
HPV感染后首先诱导宿主细胞发生一系列分子表达和功能的改变，继而发生形态学改变，检测HPV感染所致的宿主细胞内各种分子变化可作为HPV检测的衍生技术应用于子宫颈癌筛查。
●p16和p16/Ki-67免疫组化染色；
●DNA甲基化检测；
●端粒酶逆转录酶基因检测；
●miRNA检测；
●MCM2和TOP2A蛋白的检测。
HPV检测主要用于子宫颈癌筛查和子宫颈病变治疗后的随访
●联合细胞学检查作为初筛；
●单独使用作为初筛；
●细胞学ASC-US/LSIL的分流；
●子宫颈病变手术后的随访。
四、HPV检测在临床的应用［3］
1.联合细胞学检查作为子宫颈癌的初筛
●宫颈细胞学检查是传统的主要的子宫颈癌筛查方法，特异性高，但敏感性低，容易导致漏诊。
●HPV检测敏感性高，特异性低，两者的联合检测明显提高子宫颈癌筛查的敏感性和特异性，细胞学和HPV均阴性者发病风险低。
●联合筛查2012年被纳入美国30岁以上女性子宫颈癌筛查指南，ACS/ASCCP/ASCP和ACOG推荐联合筛查是30岁以上妇女首选的筛查方法。
2.单独HPV检测作为子宫颈癌的初筛［4］
●2008年欧洲生殖器感染和肿瘤研究组织宫颈癌筛查指南建议对25～64岁妇女行HR-HPV检测作为初筛，每5年一次，阳性者细胞学检查分流。
●2015年ASCCP推荐≥25岁女性采用FDA批准的HR-HPV检测技术作为初筛。
●2018年美国预防服务组织（US Preventive Service Task Force，USPSTF）以 A级证据推荐HPV初筛可用于30～65岁妇女的子宫颈癌筛查。
3.ASC-US的分流
●ASC-US中一小部分活检是高级别宫颈病变，但并非所有的ASC-US都需要转诊阴道镜检查。
●2012 ASCCP指南推荐细胞学检查ASC-US患者采用HPV检测来分流，HPV阴性3年后重复细胞学和HPV联合检查，若HPV阳性则建议转诊阴道镜。
4.子宫颈病变手术后的随访
●癌前病变患者经锥切治疗后仍有5%～20%在三年内复发，患浸润性子宫颈癌的风险比普通人群高5倍，术后需要20年的随访。
●单独HR-HPV检测在预测术后病变残留和复发的敏感性95%，特异性75%，而单独细胞学检查的敏感性70%，特异性78%，联合检查则敏感性和特异性均更高，分别为96%和81%。
●多个研究表明HPV分型检测在预后判断中显示出了更好的敏感性和特异性。
五、HPV感染与女性生殖道湿疣
●定义：生殖道湿疣是由低危HPV感染引起的鳞状上皮疣状增生病变，是一种常见的性传播疾病。
● 发病率：为160～289/100 000人·年。
●主要传播途径：性接触传播，但不排除间接传播可能。
●感染型别：低危型HPV 6和11为主，约占90%。
●常见部位：性交时易损伤的部位如外阴的阴唇后联合、小阴唇内侧、阴道前庭、尿道口、肛周及阴道和宫颈。
1.女性生殖道湿疣
●临床表现：生殖道赘生物，初为散在或呈簇状增生的粉色或白色小乳头状疣，或表现为细而柔软的指状突起，病灶增大后互相融合，呈鸡冠状、菜花状或桑葚状。
●鉴别诊断：外阴微乳头瘤病、外阴上皮内病变以及肿瘤。
●确诊有赖于活检和组织学诊断。
●治疗包括药物、物理和手术治疗。
●药物治疗：局部使用三氯醋酸、二氯醋酸溶液、咪喹莫特乳膏和鬼臼毒素乳膏等。
●物理治疗：激光、微波、冷冻、电灼、光动力治疗等。
●手术治疗：巨大的病灶也可行手术切除疣体，待愈合后再行局部药物治疗。
●四价和九价HPV预防性疫苗中均含有引起下生殖道湿疣的常见的HPV 6和11型，这两种疫苗的使用理论上可以预防将近90%的生殖道湿疣。
2.女性生殖道肿瘤
（1）HPV感染与子宫颈癌及其癌前病变：
●子宫颈癌是HPV在女性生殖系统所引起最常见的恶性肿瘤。
●HPV存在于绝大多数子宫颈癌组织及大多数癌前病变组织中，HR-HPV的持续感染是导致子宫颈癌的最主要因素。
●88.9%的高级别宫颈病变能检测到 HPV，其中HPV16是最常见的型别；85%的子宫颈癌 HPV阳性，其中71%为16和18型，94%的子宫颈腺癌患者检测到 HPV16、18和 45。
（2）HPV感染与阴道病变：
● 阴道上皮内瘤变（VaIN）发病率约为0.2～2/100 000妇女，明显低于CIN的发病率，原发性阴道癌更罕见，发病率约占妇科恶性肿瘤的2%。
●HPV感染是VaIN和阴道癌的主要病因。HPV的检出率为69.3%，根据感染率高低依次为 HPV16、58、52、39、33 和53型。
●VaIN分为VaIN1、VaIN2和 VaIN3三个级别。VaIN1为低级别的阴道上皮内瘤变，VaIN2和VaIN3为高级别的阴道上皮内瘤变，VaIN3是一种潜在的癌前病变，发展为癌的概率约为2%～12%。
●VaIN可以独立存在或与CIN同时存在，65%的VaIN同时伴有CIN或继发于原有的CIN，在CIN患者中，有2.5%～9.2%的患者同时伴有VaIN。
●绝大部分的VaIN发生在阴道的上1/3，约50%为多发病灶。
●VaIN1的治疗：期待疗法、局部药物治疗、激光消融和手术切除治疗等。
●VaIN1自然消退率高，多为期待疗法。
●高级别VaIN：局部5-FU、咪喹莫特治疗，CO2激光消融治疗，手术切除治疗包括扩大局部病灶切除和部分或整个阴道切除。
●阴道癌治疗：手术、放射治疗和化学药物治疗，需根据患者的具体情况来选择合适的治疗方案。
（3）HPV感染与外阴病变：
●外阴上皮内瘤变（VIN）包括外阴鳞状上皮内瘤变和外阴非鳞状上皮内瘤变两种类型，近年来VIN的发病率有所增加，患者年龄也趋年轻化。
●外阴癌是一种罕见的肿瘤，发病率约0.5～1.5/100 000妇女，占妇科恶性肿瘤的 4% 左右，其中90%为鳞状细胞癌。
●大多数的VIN和部分的外阴癌的发病与HPV感染有关，HPV16是最多见的型别。
●部分类型的VIN与HPV无关，如分化型外阴鳞状上皮内瘤变。多发生于老年妇女，常伴硬化性苔藓、扁平苔藓，可能系P53基因突变所致。
●VIN的治疗有局部药物治疗、局部物理治疗和手术治疗等。
●局部药物有5-FU和咪喹莫特。
●物理治疗包括激光、冷冻、电灼以及光动力治疗。
●外阴癌以手术治疗为主，辅以放射治疗和化学药物治疗。
【要点总结】
●HPV是一类无包膜的小型DNA病毒，以人为唯一宿主，可引起人类黏膜组织良性增生及恶性肿瘤。
●子宫颈癌是高危型HPV在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤。
●HPV检测主要用于子宫颈癌筛查和宫颈病变治疗后的随访。
（谢 幸）
【参考文献】
1.Bouvard V，Baan R，Straif K，et al.A review of human carcinogens-Part B：biological agents.Lancet Oncol，2009，10（4）：321-322.
2.Schlichte MJ，Guidry J.Current Cervical Carcinoma Screening Guidelines.J Clin Med，2015，4（5）：918-932.
3.Huh WK，Auil KA，Chelmow D，et al.Use of primary high-risk human papillomavirus testing for cervical cancer screening：interim clinical guidance.Obstet Gynecol，2015，125（2）：330-337.
4.US Preventive Services Task Force.Screening for Cervical Cancer.US Preventive Services Task Force Recommendation Statement.JAMA，2018，320（7）：674-686.