我国出生缺陷发生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷数90万～100万例，随着疾病模式的转变、出生死亡率的下降，出生缺陷问题日益突出，已成为我国婴儿死亡、儿童和成人残疾的主要原因之一，也是我国5岁以内婴儿死亡的首要原因，约占20% ^［1-2］，特别是全面二孩政策实施后，高龄与高危孕产妇比例增加，出生缺陷发生率有升高趋势，这给出生缺陷的防控提出了更高的要求。出生缺陷的预防分为一级预防、二级预防及三级预防。一级预防是指预防出生缺陷的发生，降低其发生率，一般在孕前甚至婚前开始干预；二级预防，通过产前筛查和产前诊断识别胎儿的严重先天缺陷，早期发现、早期干预，减少缺陷儿的发生；三级预防是对于已经出生的患儿早期干预、早期治疗，避免致残，降低致残率，减轻疾病负担。其中二级预防措施是最重要、最有效的关键环节 ^［3］，这就涉及两项专业技术，产前筛查技术与产前诊断技术。

产前筛查是指通过经济、简便和创伤小的检测方法，从孕妇群体中发现疑有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进一步明确诊断，最大限度地减少异常胎儿的出生。产前筛查作为产前诊断技术的组成部分，有利于提高产前诊断的效率。目前开展产前筛查的方法主要分为血清学筛查、无创产前检测（NIPT）及超声筛查。其中血清学筛查是通过测定孕妇血清标志物，如妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）、游离 β-人绒毛膜促性腺激素（hCG）、甲胎蛋白（AFP）等生化指标，结合超声、年龄等指标综合计算风险，对胎儿21三体、18三体、开放性神经管畸形等进行风险评估，筛选出高危孕妇，对高危孕妇进行产前诊断，从而减少上述出生缺陷患儿。

任何一个筛查项目开展的目的都是为了能向被筛查对象提供有关疾病的信息。这种信息应当有利于对疾病的诊断和防治，因此，筛查项目的普及开展必须遵循一定的标准。根据世界卫生组织1968年提出的要求，标准主要包括：①疾病定义明确，临床诊断可靠；②疾病会严重危害人体健康，甚至可能致命；③疾病的流行率相对较高且清楚，而且患病者和非患病者在人群中的分布情况明确；④具有经济效益，筛查项目本身所需要的费用低，其带来的经济和社会效益超过其给患者及其家属带来的心理副作用；⑤有相应的高度敏感性和特异性的确诊方法配合；⑥筛查阳性结果的随访措施包括向患者及其家属提供有关疾病风险和防治等的遗传咨询；⑦治疗、干预和管理策略必须有效和可接受。

筛查性检查一般具有方法简单、结果快速、成本低廉、可分析大批量标本的特点。但其敏感性和特异性均较差。所以必须遵从筛查性检查在先，诊断性检查在后，即“筛查→诊断”的原则。筛查检查的结果通常分为高危和低危两种。筛查高危只能为患者和医务人员提供“有可能患病”的信号，而筛查结果低危也不能百分百地排除患病的可能性；通常以百分比来表示这样的“可能性”（即风险率）的高低，百分比是多少则必须通过复杂的生物统计学方法进行计算才能得到。必须为筛查结果高危者提供诊断性的检查，以达到对所怀疑的疾病进行最终诊断的目的。否则，筛查检查就失去了意义。最好的产前筛查例子是目前国内外已经广泛使用的对唐氏综合征和18三体综合征的产前筛查，即所谓孕妇血清筛查。评估产前筛查可从以下3个方面考虑：

有绝对正确的金标准做参照；试验的可重复性即其他人易在相同条件下重复；筛查低危人群和低危人群中阳性率的比较，正确确定筛查试验的灵敏度，不造成偏倚。

一般要选择敏感性最高的试验做筛选试验，这样假阴性率低，被漏诊的病例较少；特异性最高的试验则用于临床确诊，这样假阳性率低，被误诊的病例较少。目前较为公认的是单一孕妇血清标记物检出率不低于20%～25%，联合母血清标记物检出率不低于55%～60%，超声纠正孕龄后假阳性率低于5%。

根据孕妇依从性、医疗服务依从性和成本-效益关系来评价筛查技术试验的实用性。

在生命起源的最初阶段，尤其是妊娠3～8周的时候，是胚胎发育的敏感期，胎儿绝大多数器官组织分化均在这个时间完成，所以这个时期是各类畸形的主要发生期，如智力低下、无脑儿、脊柱裂、脊髓脊膜膨出、唇腭裂等。在高速发展的当今社会，出生缺陷已成为公共卫生问题。在发达国家出生缺陷的发生率是2%～3%，而我国出生缺陷的发生率更高达4%～6%。再加上我国出生总数高，所以出生缺陷数量很大。而且经过几十年的产前诊断经验，染色体异常的胎儿检出率并不高，如羊水细胞核型分析结果阳性率仅为2%～3%，这说明原有高危人群的定义范围较宽泛。目前产前诊断适应对象仍以高龄孕妇占绝大多数，而实际染色体异常（以21三体为例）中只有20%是由高龄孕妇所分娩，因此如何从普通人群，特别是年纪小于35岁的人群中筛选出高危者，一直受到很多学者的关注。而产前筛查技术是针对所有孕妇的一项无创伤检查，根据相关指标结果，计算出孕妇妊娠目标染色体疾病或神经管畸形的风险率，进而对高风险结果的孕妇采取相应的产前诊断，以期最大限度地避免和减少缺陷儿的出生。与此同时，在筛查过程中还能发现部分死胎等其他先天缺陷胎儿或不良围产儿结局。可见孕妇血清产前筛查具有经济、简便、对胎儿无损伤等优点，在国内外已广泛普及，并作为孕妇常规检查项目。

孕妇在孕早期或孕中期抽取静脉血，定量测定血中某些特异性生化指标，主要有AFP、hCG或游离β-hCG、游离雌三醇（uE3）、抑制素-A（inhibin-A）、PAPP-A等。国际国内研究均认为AFP降低，uE3降低，PAPP-A降低，抑制素-A与游离β-hCG升高与胎儿唐氏综合征有关。在18三体中，母体hCG的水平是降低的，同时AFP异常增高与开放性神经管畸形相关。通过这些检测指标，结合孕妇年龄、体重、孕周等参数，运用统计分析软件计算出胎儿常见染色体疾病如唐氏综合征、18三体综合征）、开放性神经管畸形等疾病的风险，对高风险结果的孕妇采取相应的产前诊断。

目前应用广泛的血清标记物筛查指标有AFP β-hCG/游离β-hCG、uE3、抑制素-A以及PAPP-A。还有一些不断探索中的血清标记物，如特异性β1糖蛋白、胎盘生长因子、超氧化物歧化酶（SOD）、尿抗中性粒细胞碱性磷酸酶等。

其中，PAPP-A是孕早期最为敏感的指标；AFP、uE3和抑制素-A是孕中期的敏感指标；而β-hCG/游离β-hCG在孕早、中期都很敏感。但是各种标记物单独应用时都存在检出效率不高的问题，因此，学者们经过长期的研究，认为多项标记物联合筛查可以取得较高的筛查效率，符合卫生经济学效益。而不同的孕期，选择的敏感指标各不相同 ^［4］。

1）妊娠早期联合筛查：妊娠早期筛查能尽早发现染色体异常胎儿。妊娠早期筛查的最佳筛查时期是11～13 ⁺⁶周。

2）妊娠中期联合筛查：最佳筛查时间为15～20 ⁺⁶周。

3）妊娠早、中期序贯筛查：该筛查方案是分别计算每个孕妇孕早期和孕中期的风险值从而得到两份报告，最后结合早、中孕的筛查结果计算出一个综合的风险值，高危患者进行羊水细胞核型分析。该方法提高了检出率，降低了假阳性率，但应用过程中成本较高，并且有部分孕妇难以完成孕中期筛查部分，特别是孕早期高风险的孕妇，难以等待孕中期筛查，而孕早期低风险的孕妇，有一部分放弃孕中期筛查。

4）妊娠早、中期联合筛查：妊娠早期进行早期的血清标记物的检测，至妊娠中期再次进行中期的标记物的检测，结合孕妇年龄、孕周、体重、超声检测颈部透明层（NT）厚度等因素，综合计算孕妇妊娠目标染色体异常胎儿的风险度，孕妇最终会得到一个筛查报告。当结果为高风险时，需要进行遗传学诊断。联合筛查减少了孕早期有创产前诊断的使用。

1）颈项透明层厚度测量：21三体检出率约77%，假阳性率5%。

2）孕早期的血清筛查（PAPP-A和游离 β-hCG）：21三体检出率约65%，假阳性率4%。

3）孕早期颈项透明层厚度测量和孕早期的血清筛查：21三体检出率约85%，假阳性率5%。

4）孕中期两联筛查（AFP 和 hCG）：21三体检出率约56%，假阳性率5%。

5）孕中期三联筛查（AFP、hCG、uE3）：结合孕妇年龄的三联筛查，21三体检出率约65%，假阳性率5%。

6）孕中期四联筛查（AFP、hCG、uE3、抑制素 -A）：检出率约75%，假阳性率5%。

7）早中孕联合筛查（四联筛查、颈项透明层厚度测量、PAPP-A）：21三体检出率约89%，假阳性率5%。

注：检出率均为经过孕妇年龄校正后的结果。

不仅检测指标的组合方案有多种，同样检测这些血清学指标的实验室方法也有不同，主要有以下几种：放射免疫法、金标法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）、化学发光免疫法、无创产前检测等。

1）特点：应用放射免疫法进行产前筛查早而且应用时间也较长，其检测的特异性和灵敏度作为定量测定的可靠方法为大家所公认。但是用该方法检测受到提纯或碘处理过程导致影响结果，试剂的稳定性差、有效期短，设备有特殊要求，使它在一般实验室开展受到限制。此外，此方法存在放射性污染，应用范围受到限制。因此现在已经极少使用。

2）原理：放射免疫法是利用放射性核素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。

1）特点：1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。在医学检验中的应用主要是免疫层析法（immunochromatography）和快速免疫金渗滤法（DIGFA），用于检测HBsAg、hCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。

2）原理：取待检测的孕妇血清标本与工作液混溶，并加样于试剂条，混合液通过毛细作用携金迁移至检测带T带和质控带C带，从而分别出现不同颜色的粉色带，其中质控带C带的出现，不仅表示此次测试正确与否，更重要的是定量标示C带的AFP（或hCG）浓度，而检测带T带的色带深度取决于标本中AFP（或hCG）的浓度，因此，对比检测带T带和质控带C带的颜色深度，就可以确定待检孕妇血液的AFP（或hCG）的浓度范围。

金标法是在ELISA的基础上发展起来的，它的检测敏感性为70%～85%，特异性约为94%，而其假阳性仅为5%。曾经在国内外广泛应用。主要用于妊娠14～17周孕妇的唐氏综合征筛查。它具有检测灵敏度较高、安全方便、检测时间短（10min左右即可观察结果）等多项优点。但由于检测准确性差，有较高的假阳性和假阴性率而目前极少采用。

1）特点：ELISA是采取抗原与抗体的特异性反应与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量或定性测定。其方法简单，方便迅速，特异性强，因此在免疫化学中推广极快。

2）原理：将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。同时使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。

ELISA曾是产前筛查唐氏综合征较为常用的检测方法，其检测特异性可达到95%，敏感性可达到75%～85%，且检测成本低，实验操作简单，重复性好，曾在国内外应用十分广泛。但ELISA本身受固相反应的制约，同时酶标显色的稳定性易受环境温度和酸碱度变化的影响，实验重复性差，故ELISA并非理想的检测技术。

1）特点：时间分辨荧光免疫分析是近年发展起来的一种微量分析方法，是在荧光分析的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。是目前最灵敏的微量分析技术，其灵敏度高，较放射免疫分析高出3个数量级。它利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响。与普通分光不同，光电接收器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接收器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。常规荧光免疫不同，所用标记物不是普通荧光物质，而是镧系稀土元素铕（Eu ³⁺）、钐（Sm ³⁺）、铽（Tb ³⁺）等，检测设备也不同于一般的荧光分光光度计，而是使用时间分辨荧光计测量，排除样品中非特异荧光的干扰，极大地提高了测定方法的灵敏度。时间分辨荧光免疫分析在灵敏度、特异性、稳定性及测量自动化程度等方面都表现优异，而其标准曲线范围宽（跨越4～5个数量级），最小检出值可达10～18mol/L，分析速度快，通量高，远远超过放射免疫分析及发光免疫测定，同时操作简便，无放射性污染，因此成为免疫分析中具有发展潜力的一项技术，特别是在大规模筛查方面具有明显优势。

2）原理：将镧系元素铕（Eu ³⁺）、钐（Sm ³⁺）、铽（Tb ³⁺）等通过具有双功能基团的螯合剂标记于抗体（或抗原）分子上。当标记抗体和待测抗原结合，采用紫外脉冲光源（340nm，每秒闪烁1 000次）进行激发，不仅发射出高强度的荧光（613nm），而且衰变时间也较长（10～1 000μs）。利用延缓测量时间，待短寿的本底荧光（样品池和待测样品中蛋白质等自然发生的非特异性荧光，衰变时间1～10ns）全部衰变后，再行测量，所得信号完全为长寿命镧系元素螯合物的特异荧光，从而有效排除非特异本底荧光的干扰，大大提高分析的特异性和灵敏度。此外，Eu ³⁺或Sm ³⁺的激发光与发射光之间有很大的Stokes位移，而且激发光的光谱较宽，有利于增高激发能，增强标记物的比活性；且发射荧光的谱带很窄，有助于降低本底，从而提高分析的特异性和灵敏度。时间分辨荧光免疫分析具有标记物制备简单、有效期长、无放射性污染、标准曲线工作范围宽、应用范围广以及可进行双标记，甚至多标记等优点，且它具备高敏感性和广泛的测量范围，出色的室间分析重复性，稳定可靠的商品化试剂，既没有放射免疫法中的试剂问题，也没有ELISA受固相反应的限制及基质底物影响的问题，是一种适合在一般实验室推广开展的分析方法。目前在我国应用比较广泛 ^［14］。

1）特点：化学发光免疫法具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放射免疫分析、ELISA、荧光分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。20世纪70年代中期Arakawe首先报道此方法，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术。应用范围广泛，近年来发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前比较先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比ELISA高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、ELISA。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长（6～18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。

2）原理：化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光子产量。免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上，或酶作用于发光底物。

化学发光免疫法检测灵敏度高，可达10～15ng/L，化学反应简单、快速而无需催化剂，使得它在产前筛查领域应用广泛。采用吖啶酯类化合物（acridinium ester）作为标记物的优点是低背景噪声、化学反应简单、快速且无需催化剂。

此外，还有国内较少使用的磁性分离酶免疫法。它是20世纪80年代中期瑞士Serono诊断中心发明的一种非放射性核素免疫检测的先进技术，称为磁性抗体免疫测定（MAIA）技术，具有分离完全、快速、显色稳定、重复性好的优点。有报道此方法筛查唐氏综合征的检出率75%，假阳性率5.2%。

1997年，香港中文大学卢煜明教授证实了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，通过利用高通量测序技术对母体外周血中胎儿游离DNA进行定量分析及生物信息分析，最终可实现对胎儿的染色体非整倍体患病风险进行评估，这类基于二代测序的母体血浆胎儿游离DNA检测技术称为无创产前检测。母体外周血含有的胎儿游离DNA，几乎全部来源于胎盘滋养层细胞，目前筛查的目标疾病包括21三体、18三体和13三体综合征。因该技术高检出率和低假阳性、低假阴性率，使行介入性产前诊断的孕妇数量大大下降，已经被越来越多的孕妇和检测机构采用。除了目前检测费用较高、实验较复杂以外，无创产前检测已经逐渐成为孕期筛查的重要手段之一 ^［15-16］。

杂合子筛查（heterozygote screening）是指在非患病者群体中对某些隐性遗传病杂合子的筛查，又称携带者筛查。通过杂合子筛查可以将携带者（carrier）检测出来，进而对人群中的携带者频率、携带者本身健康状况及其生育患病后代的风险进行评估。携带者的检出对遗传病的预防具有积极的意义。因为人群中，虽然许多隐性遗传病的发病率不高，但杂合子的比例却相当高。例如苯丙酮尿症的纯合子在人群中比例如为1：10 000，携带者（杂合子）的比例为 1：50，为纯合子的 200 倍 ^［17-18］。

对发病率很低的遗传病，一般不做杂合子的群体筛查，仅对患者亲属及其对象进行筛查，也可以收到良好效果。对发病率高的遗传病，普查携带者效果显著。例如我国南方各省的α及β珠蛋白生成障碍性贫血的发病率特别高（共占人群8%～12%，有的省或地区更高），因此检出双方同为α或同为β珠蛋白生成障碍性贫血杂合子的机会很多。这时，进行婚姻及生育指导，配合产前诊断，就可以从第一胎起防止重型患儿出生，从而收到巨大的社会效益和经济效益，不仅降低了本病的发病率，而且防止了不良基因在群体中播散。目前国内在某些城市、地区或某些医院已经开展珠蛋白生成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、耳聋基因杂合子筛查。也有筛查家族性杂合性高胆固醇血症、镰状细胞性贫血杂合子、苯丙酮尿症杂合子研究报道，但还较少用于临床。国外有报道常规开展黑色人种中的镰状细胞病、犹太人中的泰-萨克斯病以及北欧白色人种的囊性纤维变性等杂合子筛查。

脆性X综合征前突变筛查也属于这类筛查。超过95%的脆性X综合征是由于（CGG）n重复扩展的动态突变和异常甲基化而导致FMRP蛋白合成减少或缺失所致，不到5%的患者是由于 FMR1基因的缺失突变或点突变而导致FMRP蛋白功能异常而致病。因此建议在高危人群中进行 FMR1基因的动态突变检查。

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产前诊断又称宫内诊断或出生前诊断，是指直接或间接地对孕期胎儿情况进行检测，继而采取一些必要的措施防止严重遗传病、先天性畸形和智力障碍患儿的出生，提高人口素质。产前诊断是近年发展起来的一个新领域。传统的产前诊断方法为绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺和脐带血穿刺。近年来，随着医学分子生物学和细胞生物学的发展，产前诊断借助于一些分子细胞生物学技术已使非侵入性产前诊断成为可能，并且可使高危胎儿的基因突变分析或连锁诊断成为可能。可以说是分子生物学推动了产前诊断的发展。产前诊断从有创伤性向无创伤性推广的过程中，分子细胞生物学技术更是具有举足轻重的作用 ^［1］。

产前诊断技术可分为创伤性产前诊断和非创伤性产前诊断，前者包括绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带血穿刺及胎儿镜检查；后者包括植入前诊断、胎儿细胞诊断、宫颈黏液冲洗及超声诊断。产前诊断由一系列预测胎儿出生前是否患有某些遗传性疾病或先天畸形的技术方法完成。在遗传咨询的基础上，应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学技术，对胚胎和胎儿的直接检测或通过母体检测，预测胎儿在子宫内生长发育状况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形，以便早期发现，这是预防患儿出生的有效手段。我国每年有90万～100万新生儿患有出生缺陷，占新生儿的5.6%。第1位是先天性心脏病，每年约22万例；第2位是神经管畸形，每年约10万例；第3位是唇腭裂，每年约5万例；第4位是唐氏综合征，每年约3万例。出生缺陷的原因分为两大类，一类与遗传因素相关，一类与环境因素相关。与遗传相关的有单基因遗传病、多基因遗传病、染色体病和线粒体病。与环境有关的致畸因素包括营养、疾病、感染、药物和接触有害物质等。随着人类健康水平的改善，原来儿科死亡率甚高的非典型遗传性疾病（如营养不良、传染病及感染性疾病）逐年减少，而与遗传有关的疾病则相应增加。据目前临床资料分析，普通人群中的遗传病流行率可高达73‰。甚至有人认为，除了外伤性骨折以外，其他疾病都与遗传因素有关。

在各种常见的遗传病中，我国人群中唐氏综合征的发生率大致与国外相似，在1/800～1/650；各地的苯丙酮尿症、进行性假肥大性肌营养不良等遗传病的发病率也与国外接近；中南部地区的珠蛋白生成障碍性贫血发病率高；先天性神经管畸形在我国北方部分地区高发；环境污染容易使孕妇接触致畸物质而导致胎儿染色体畸变风险高；感染性疾病、性传播疾病仍然相当普遍等：所有这些事实说明了广泛建立和健全产前诊断的必要性。目前，产前诊断已成为国外发达国家临床产科学的重要组成部分。在发达国家，大多数的35岁和35岁以上的孕妇都能接受产前诊断检查，对常见的唐氏综合征的产前诊断早已被明确列为产科常规检查项目之一。产前诊断的主要目的是为可能出现遗传病或与遗传因素有关的疾病以及具有其他导致畸胎因素的高风险家庭提供充足可靠的信息，使他们能够在妊娠期对异常的胎儿作出自己适当的选择。其具体表现在：①为高风险夫妇在计划怀孕之前提供风险咨询；②当诊断结果正常时，为风险家庭提供肯定证据，使之放心；③在诊断结果异常时，有关专业人员及时做好异常胎儿出生时和出生后处理的准备；④及早为个别愿意保留患病胎儿的孕妇提供有关遗传病的信息，做好精神上的准备，以利于妊娠期间或分娩后子女的保健和抚养；⑤为计划终止妊娠的风险夫妇提供信息，使他们在精神和物质上做好准备。

产前诊断直接关系胎儿健康及孕妇家庭的精神经济压力问题，故产前诊断项目的建立必须采取严肃认真的科学态度，并要具备一定的条件和遵循一定的标准。这主要包括：①疾病应该有明确的定义以及诊断标准；②疾病严重，需要终止妊娠；③对疾病无法治疗或疗效很差；④疾病向下代传播的风险高；⑤终止妊娠可被孕妇接受；⑥具有准确性高、特异性高、敏感性高的产前诊断方法。产前诊断需要有专业的医疗人员队伍，同时也要求多种专业学科的配合，其中包括产科、儿科、检验科、临床遗传、细胞遗传、生物化学遗传、分子遗传以及遗传咨询等 ^［2］。

可以进行产前诊断的疾病大概分为6大类 ^［3-4］：①胎儿感染（如巨细胞病毒感染、风疹病毒感染、单纯疱疹病毒感染、弓形虫病及性传播疾病等），目前主要采用免疫学及病原微生物核酸检测方法诊断；②染色体病［如唐氏综合征、13三体综合征、18三体综合征、特纳（Turner）综合征等］，主要采用细胞遗传学方法诊断；③先天结构畸形（如开放性神经管缺损、先天性心脏病、腹壁缺陷、先天性髋脱位、先天性马蹄内翻足等），主要采用超声、胎儿磁共振等影像学诊断；④遗传性代谢疾病（如糖原贮积症、黏多糖贮积病、半乳糖血症、苯丙酮尿症、枫糖尿症等），主要采用生化遗传学方法诊断；⑤单基因疾病（如进行性假肥大性肌营养不良、珠蛋白生成障碍性贫血、血友病、脆性X综合征等），主要采用分子遗传学方法诊断；⑥其他。目前，在我国进行产前诊断的疾病仍然以胎儿感染疾病、先天结构畸形和染色体病等三大类为主。由于染色体病与孕妇年龄关系密切，随着我国孕妇年龄的升高以及卫生环境不断改善，染色体病占产前诊断中的比例越来越大。随着基因组工程的逐步完善和致病基因不断被发现，单基因疾病的产前诊断也呈现逐年增加的趋势。

预防及降低遗传性疾病和先天缺陷胎儿的出生，提高出生人口素质和生命质量，是世界各国普遍关心的问题，也是世界文明进步和社会发展所必需的。在产前诊断与干预处理中，医师应该遵循患者利益第一和尊重患者自主选择的伦理学原则，从事产前遗传咨询和产前诊断的医生有责任和义务，根据现有的实验室检查和临床分析得出产前诊断结果，告知夫妻双方胎儿的情况和可能的预后，但医生不得有任何暗示或诱导夫妻双方做进一步选择的行为。在知情选择的基础上，根据上述各项处理原则，夫妻双方有权作出自己的选择。应当遵循把胎儿当作患者对待的伦理学概念。产前诊断与干预处理前，医师应向孕妇详细告知方案的利弊，供孕妇选择和作出最终的决定。对于出生后具有生存能力的畸形胎儿，尽管存在增加发病率和死亡率的危险，然而除非孕妇本身的情况不允许继续妊娠，否则胎儿伦理学原则反对终止妊娠。如夫妻双方有意愿终止妊娠，根据《中华人民共和国母婴保健法》第三章第十九条的规定，经本人同意，并签署意见；如本人无行为能力，应当经其监护人同意，签署意见，方可以考虑施行人工流产终止妊娠。但是，将有先天缺陷的胎儿进行人工流产，违背了医学上抢救生命的基本宗旨，也违反了人人平等的准则，同时涉及伦理道德及妇女本身、胎儿、家庭和社会诸方面的利益。因此，不可能完全脱离人们对某些特殊利益的信仰，如家庭、职业、区域、民族、宗教、文化或理想，也不能脱离特定社会的道德传统去谈论有关人工流产的伦理。为此，在产前诊断中涉及道德选择问题上，米伦斯基提出了四项基本准则：第一，尊重夫妇双方的选择；第二，对个人和家庭不产生伤害；第三，产前诊断的结果可靠；第四，产前诊断和遗传咨询的自愿性。尽管各国存在着文化、社会制度、道德标准的差异，但这些准则无疑在世界各国有着共同性。

传统的细胞遗传学是通过研究人类染色体的数目、结构和功能的改变与疾病发生的关系，从而指导对疾病的诊断和再发风险的评估 ^［5-6］。

1912年，von Winiwarter通过检查人睾丸切片，观察到有丝分裂，认为男性的染色体为47条，而推测女性的染色体为48条。1952年，Hsu采用低渗法制备染色体。 1956年，Tjio和Levan 在收获细胞前向培基中添加秋水仙素，改进低渗制备法，确定了人类二倍体染色体数目确定为46条，从而奠定了临床细胞遗传学的基础。1959年，Lejeune等发现唐氏综合征患者染色体为47条，多了一条小的G组近端着丝粒染色体（21号染色体）。1959年，Jacobs和Strong发现克兰费尔特综合征患者骨髓细胞的有丝分裂相中，染色体为47条，多出的染色体属于包括X染色体在内的一组染色体，其核型暂定为47，XXY。1959年，Ford等证明Tuner综合征的核型只有45条染色体。1960年丹佛城国际会议确立了染色体命名体系（丹佛体系），从此染色体病有了统一的命名。染色体分为 7 组：A（1～3）、B（4～5）、C（6～12）、D（13～15）、E（16～18）、F（19～20）、G（21～22），X染色体大小与C组接近，Y染色体与G组相似。1978年，国际细胞遗传学命名委员会首次出版了人类细胞遗传学命名国际体系（ISCN），规定了正常染色体和异常染色体核型的命名格式和原则。此后，ISCN的专家委员会持续对ISCN进行修改和更新，并定期发布最新版的ISCN至今。

正常人类体细胞有46条染色体。其中，正常男性染色体核型为46，XY，而正常女性染色体核型为46，XX。这种由22对常染色体和一对性染色体组成的核型称为二倍体。除男性性染色体外，每一编号染色体都由一对同源染色体组成，其中一条来自于父方，另一条来自于母方。而配子核型的染色体组为22，X或22，Y，称为单倍体。

应用特殊染色体显带技术可以使染色体呈现出明暗相间的条带。不同编号染色体所出现的条带数目、形态和排列是不同的。这种染色体带纹的排列称为带型。辨认每一条染色体是通过识别染色体上稳定的和具有显著形态特征的带纹进行的，这些特征包括着丝粒、染色体长短臂以及某些特征性的条带。

染色体数目或结构的改变称为染色体畸变，是引起染色体病的原因。

染色体数目的异常包括整倍体和非整倍体。前者染色体数目的改变是一个染色体组的倍数，例如三倍体、四倍体；后者染色体数目的改变不是一个染色体组的倍数。非整倍体又分为亚二倍体（如45，X综合征见图2-2-1）和超二倍体，如唐氏综合征（图2-2-2）、47，XXY综合征、48，XXXY综合征等。

染色体的断裂和断裂以后断端异常重接是染色体机构畸变的遗传学基础。常见的结构畸变有缺失、重复、易位、倒位、插入、环状染色体、双着丝粒染色体等（图2-2-3～图2-2-6）。同时还有可能形成标记染色体。

细胞遗传学实验室诊断是通过细胞培养进行传统染色体分析的过程，是对染色体病进行诊断的主要方法。由于从具有分裂能力的细胞中得到染色体，细胞培养是细胞遗传学诊断的关键步骤。常用于实验室染色体诊断的组织包括羊水、绒毛、外周血。其中，外周血淋巴细胞需要通过分裂素的刺激才能获得分裂能力。细胞遗传学实验室中各种类型细胞培养的步骤及其操作要求基本一致，主要包括培养前准备（试剂准备、无菌条件下标本的采集等）、细胞培养以及细胞收获。各项步骤均会直接影响诊断的成败。诊断实验室应该拒绝接受没有患者姓名或标志不清的标本 ^［7］。

羊水中的细胞来源于胎儿的多种组织，其中主要包括皮肤、泌尿道、胃肠道以及羊膜，这些细胞统称为羊水细胞。羊水中的多数羊水细胞都已死亡，所以不能直接得到用于核型分析的中期细胞。必须先将羊水低速离心，使具有生长能力的羊水细胞分离出来，然后将细胞加到培养液里进行培养。

孕中期通常可以抽取20ml羊水。最初抽出的1～2ml羊水可能混有母体细胞，故通常弃去不用。抽出的羊水样本放置在无菌离心管里。羊水必须在室温下保存和运送，并应尽快送到诊断实验室进行处理，以得到满意的细胞培养效果。

由于绒毛的滋养层细胞具有自我分裂能力，所以绒毛有直接收获和常规的长期培养两种方法。直接收获不需要细胞培养，而是经过酶处理使单个细胞各自分离后就可以在当天收获。长期培养则需要7～10d的培养，得到足量的中期细胞才收获。

在条件允许的情况下，应该要求诊断实验室技术员参与绒毛取样时的标本收集，现场显微镜下对绒毛进行检测，以确保绒毛标本的质量。通常，每例所要求的纯净绒毛量应该不少于10mg。只有在确定已有足够量的绒毛组织后才结束绒毛取样手术。必须把绒毛标本迅速送到诊断实验室进行细胞培养前的处理。

母体细胞污染是绒毛取样过程中常见的现象，约占全部绒毛细胞培养病例的1.9%。为避免或减少母体细胞的污染，必须进行胎儿绒毛净化，把来源于母体的、表面光滑的蜕膜从绒毛组织中分离出来并将之弃去。此外，在绒毛净化过程中还必须将血凝块和其他杂质清除掉。

用于产前遗传病诊断的实体组织标本主要为绒毛和流产胎儿活检组织。目前对实体组织的细胞培养都是先将其经过酶消化处理，使单个细胞从组织中分离出来，然后按羊水细胞培养法进行处理。能对组织进行消化处理的酶主要有胶原酶和胰蛋白酶。后者消化作用强，但是会损害细胞膜的结构，使用时必须掌握好其浓度和时间。在对绒毛进行酶处理之前，要把混在绒毛组织中的母源性组织和血块清除掉。同样，也应该清除掉其他实体组织标本里的脂肪、失去活力的坏死组织和血块。

胎儿脐带血细胞来源于胎儿的中胚层组织。脐带穿刺取得胎儿血，可以用于比较快速地进行胎儿染色体检测，还可以用于诊断胎儿血液系统疾病。脐带血穿刺通常在妊娠中晚期进行。在超声引导下，行脐带穿刺，抽血1～3ml，置于肝素抗凝管中，尽快送到诊断实验室进行处理，并开始细胞培养。脐带血细胞中用于染色体检测的是有核细胞，以淋巴细胞为主。由于脐带血中红细胞较多，黏稠度大，因此在培养过程中要注意细胞的浓度。

细胞培养的目的是在适合细胞生长的环境下，通过有丝分裂刺激因子等刺激，使处于分裂静止或分裂不活跃状态的细胞转化为具有分裂能力或分裂活跃的细胞，从而为生化或分子遗传诊断提供足够量的细胞，为细胞遗传诊断提供分裂中期细胞以进行核型分析，制作特殊细胞系并将其长期冷藏保存。

影响细胞培养结果的因素很多，其中包括培养液的使用、培养皿的选择、标本处理，以及细胞培养过程中各重要步骤如接种和细胞收获等。它们之间关系密切，互相影响。

温度、湿度以及培养液的pH都会直接影响细胞培养的效果。

所有的组织细胞都需要在培养液中生长，以利于细胞的生长和分化。不同组织细胞的培养必须选用不同的培养液。所有的培养液都是一种平衡液，含有不同细胞生长所必需的物质，其主要成分包括盐类、葡萄糖及酸碱缓冲系统等。大部分的培养液都加有酚红pH指示剂以显示其酸碱度。当培养液酸性太强时，颜色变黄；而在碱性太强时则变成粉红色。

培养液分为完全培养液和非完全培养液。非完全培养液使用前必须加配血清、抗生素、L-谷氨酰胺或其他细胞生长因子等，才能变为完全培养液而使用。

抗生素可阻止微生物在培养液中生长。部分抗生素会抑制细胞的生长，所以不宜过多地使用。常用的抗生素包括青霉素/链霉素混合剂、庆大霉素以及卡那霉素。抗真菌药物包括制霉菌素和两性霉素B，抗真菌药物可直接抑制细胞的生长，只有在不能控制真菌生长的情况下才使用。

当细菌污染时，细胞培养液通常变得混浊；发生霉菌污染时，就会出现棉花样改变。在倒置显微镜下可以容易地观察到细菌及霉菌的生长。支原体和病毒污染通常不易被发现。支原体污染可以使染色体发生断裂或引起染色体重排。

避免微生物污染最关键是无菌操作。

只有绒毛的滋养层才具有分裂能力的细胞。外周血主要为成熟淋巴细胞，必须经过有丝分裂刺激因子的刺激后才能分裂。常用的有丝分裂刺激剂是从红腰豆中提取的植物凝血素（PHA），它只作用于T细胞。PHA加入48h后细胞开始明显分裂，并在68～72h达最高峰。因此，常规的外周血培养是在PHA加入72h后开始收获。

除有丝分裂刺激因子外，能刺激细胞生长的还有生长因子，例如B细胞生长因子、髓细胞生长因子及纤维细胞生长因子等，可以根据不同的诊断目的选用。

分为开放系统和密闭系统两种。开放系统的培养皿盖保持松弛，使培养皿内外空气能够流通；密闭系统的培养皿盖保持密闭状态。

产前诊断实验室通常采用开放系统进行细胞培养，通常5%二氧化碳的培养箱，以使培养液的pH保持在7.2～7.4的范围。由于培养瓶内外空气流通，培养液容易蒸发，故通常在培养箱内放置无菌水以保持箱内湿度。由于培养箱内温度高、湿度大，容易发生微生物（特别是真菌）污染，这是使用开放系统的主要缺点。

密闭系统的培养液含缓冲系统以保持pH的恒定。由于密闭系统不需要湿度调节，故培养箱能保持干燥，微生物污染机会少。

不同种类细胞的培养时间和处理方法差异很大。外周血细胞培养时间通常为72h，培养过程中一般不需要进行特别处理。羊水细胞、绒毛细胞以及其他实体组织细胞的培养所需时间较长，通常为5～10d或更长。用原位培养法进行培养的羊水细胞一般在8～9d内收获，而用T型培养瓶法则需要10～12d。在超过1个月细胞仍然不生长时，便可以算为培养失败。

细胞培养分成悬浮培养和贴壁培养两种。悬浮培养用于血细胞培养；贴壁培养用于羊水细胞、绒毛细胞的培养。

T型培养瓶法既可用于细胞原代培养，也可用于细胞传代培养。细胞通常生长在培养瓶内的表面，待细胞分裂旺盛时及时收获。细胞收获前必须进行胰蛋白酶处理，使生长中的细胞从瓶壁表面脱落并形成游离的单个细胞，然后将其收集到试管里，进行收获T型培养瓶法收获后的细胞已全部脱落，当发生单个异常核型时，难以判断其细胞集落的来源。

已被广泛应用于产前诊断中。该方法使细胞在培养皿内贴壁生长，收获时不需经过酶处理，处于分裂中的细胞仍然保留在原来生长的位置上。优点为每个细胞集落都由单个细胞分裂后形成的细胞组成，所在细胞集落里出现的染色体改变，通常代表了培养前单个细胞的核型而体现了标本基因组成的真实性，有利于鉴别产前诊断过程中常出现的嵌合体。原位培养法的收获过程减少了酶处理这一步骤，缩短收获时间，减少人为误差，能有效地保证细胞培养质量。

经过适当时间的细胞培养，待细胞生长旺盛，分裂出一定数目的中期细胞时，就可以进行细胞收获。收获的目的是尽量收集处于分裂过程的中期细胞。准确掌握细胞收获时机，是影响细胞培养结果的重要环节，收获时间判断的准确性与操作者的经验有关。细胞生长不足和生长过度，都不能收集到足够数量的中期细胞或其染色体形态不理想。因此必须在倒置显微镜下注意观察细胞生长及其分裂的变化。中期细胞在倒置显微镜下表现为有折射的小圆形细胞，且通常分布在细胞集落的边缘。

目前广泛使用的有丝分裂抑制素是秋水仙素或秋水酰胺。秋水酰胺可以通过与管蛋白的结合，抑制纺锤体的合成或破坏已形成的纺锤体，阻止后期姐妹染色单体之间的分离，从而使细胞的有丝分裂停留在分裂中期。秋水酰胺浓度及其作用时间与染色体形态关系密切。在一定浓度下，秋水酰胺作用时间越长，中期细胞越多，但染色体越短。

细胞低渗处理使收获后的细胞处于低渗溶液环境下，通过渗透作用使细胞膨胀变大的过程。低渗液的盐浓度比细胞质内的低，这使得水分在渗透压的作用下透过细胞膜进入细胞内，使细胞破裂，染色体均匀分布。低渗处理的时间很重要，时间太短不能使细胞充分膨胀，染色体交叉过多不易诊断；低渗时间太长，细胞过度膨胀而破裂，染色体会分散过度，造成人为的染色体丢失。目前使用的低渗液主要包括0.075mol/L的氯化钾溶液、0.8%的枸橼酸钠溶液、氯化钾/枸橼酸钠混合液等。

细胞固定是通过固定液使细胞膜蛋白变性，终止细胞膜的水分渗透，使细胞固定在膨胀状态。最常用的固定液是甲醇/冰醋酸混合液（3：1）。固定液能吸收空气中的水分从而影响固定作用，因此应注意保持密封，宜每次新鲜配制使用。固定时间直接影响染色体的形态和分散度，制片前必须进行至少两次固定处理，每次不应少于15min。

滴片是将经过固定的细胞悬液滴在玻片上，使染色体分散。细胞悬液的浓度要适中，通常先制作一张玻片，然后在倒置显微镜下观察滴片效果，如果发现细胞密度太大则需要适当稀释。理想的滴片，有足够多的分裂相中期细胞；细胞密度适宜；染色体分布均匀，交叉少；染色体形态清晰且直；镜下看不到细胞质。

有多种因素可影响滴片的效果，包括温度、湿度、玻片洁净程度、滴片距离以及滴片时玻片的角度等。使用的玻片必须经过多次洗涤，将玻片上的杂质特别是油渍清洗干净，然后泡在冷冻的蒸馏水中保存。从水中取出时，质量好的玻片表面应保持一层均匀的薄水膜。滴片后应将玻片放在加热炉或干燥板上进行干燥处理。一般在60℃下隔夜干燥或在90℃下干燥1h。

核型分析的目的是将畸变的染色体作出准确的诊断。影响核型分析的准确性因素主要包括制片质量、染色体显带染色的质量和分析者的经验及能力。

核型分析时按一定的方向进行，先用低倍镜查找，见合适的中期细胞时再转换到高倍镜下进行分析，应选择形态好的细胞进行核型分析，而且必须对每对染色体逐带对照；准确记录记数及核型分析坐标；必须对20个细胞进行数染色体或分析；每例分析的细胞必须来自两个以上不同的培养皿；原位培养时，每个细胞集落只选用一个中期细胞；当出现镶嵌体时，则按照有关标准的要求进行，原则记数100个细胞；染色体分析所需的带水平应为400左右，而微小的结构性染色体畸形分析则必须用550以上的带水平；产前诊断病例的诊断结果必须由副高以上职称有资质的技术人员核对签名发放报告。

近年来染色体自动扫描分析系统已经得到越来越广泛的应用。对染色体的识别程度取决于显微镜的分辨率和分析软件的能力。

不同实验室的条件不一，技术人员的习惯各不相同，每个实验室应建立自己的实验室常规，这里介绍的程序只能作为参考。

有多种用于羊水细胞的培养液，必须保存在-20℃环境下，解冻后两周内应使用完毕。

羊水细胞培养前先用紫外线灯消毒培养操作台20min，全部操作在无菌条件下进行。羊水细胞培养瓶为无菌一次性使用。

将无菌条件下取来的20ml羊水分装放入两个离心管（A与B）内（每管10ml），在1 000r/min的条件下离心5min，弃上清，留约0.5ml沉淀物（注亦可不离心做全羊水培养）。

无菌条件下将离心后的细胞小团打散，分别将离心管中的沉淀物放入A和B培养瓶内，培养瓶应标注患者姓名、实验室编号、培养皿编号、种植日期以及操作技术员姓名。每个培养瓶分别加入McCOY 5A培养液3ml及小牛血清1ml（或全培基4ml），密封瓶口，37℃培养。每个培养瓶分别放在不同的培养箱里。

从种植后第4天开始，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，选择适当时机收获。密切注意观察细胞生长情况，切忌细胞集落过度生长。即使稍微过度生长的细胞集落，都会明显地减少中期细胞数。

如果第6天还不能收获，必须换液，同时小心地将培养瓶中的红细胞以及其他杂物清洗干净。以后每间隔3d，更换培养液一次。通常在细胞贴壁生长之前不换液，在良好的培养条件下，每个培养皿里通常可以得到5～20个含中期细胞的细胞集落。

1）秋水酰胺作用：收获前3h加入秋水酰胺，最终浓度为0.1mg/L。

2）低渗：收获时小心吸出培养液，避免搞混细胞集落，将培养液全部倒出，用0.6%的枸橼酸钠低渗液10ml，37℃低渗处理40min。通常按照湿度越高低渗时间越短的原则调整。

3）预固定：取 3：1 的甲醇：冰醋酸固定液 1ml，小心缓慢地加入瓶内低渗液中。立即用吸管吸出1ml混有固定液的低渗液，重复3次，最后将瓶中液体全部倒出，再加1ml固定液，洗去瓶内残存的低渗液，吸出弃之。

4）固定：加入新的 3：1 甲醇：冰醋酸固定液 6～7ml，放置4℃，固定1h。

由于在收获过程中细胞始终附着在培养瓶上，故切忌动作粗鲁，以免使易于脱落的中期细胞丢失。

5）干燥：切除塑料瓶顶盖，将固定液倒出甩干，用酒精灯烤干瓶上的液滴，放温箱37℃中干燥。在收获后的培养玻片背面标注患者姓名及实验室编号，以免标本混淆。

G 带染色。

1）胰酶处理：将玻片投入0.24%乙二胺四乙酸（EDTA）和0.06%胰酶混合液中处理消化0.5～1min（视情况而定）。

2）吉姆萨染色：消化完毕取出玻片立即投入吉姆萨染液中染色5min。

3）干燥：用自来水冲掉浮色，在空气中干燥，随后将培养盒四周拆除。

每例计数不同集落共15～20个分裂相，分析3～4个核型，必要时增加计数及分析数。细胞遗传学诊断标准按人类细胞遗传学命名国际体系（ISCN）进行。

1～5步骤同羊水细胞原位制片法。

1）秋水酰胺作用：收获前3h加入秋水酰胺，最终浓度为0.1mg/L，混匀后放回培养箱。

2）收集羊水细胞：将培养液倒入离心管中，用0.2%EDTA与0.5%胰酶混合液1ml倒入培养瓶内，将贴壁生长的细胞洗涤两遍，将洗下的细胞收集到相应的离心管中；加入2ml胰蛋白酶-EDTA混合液，放回培养箱放置2～5min，直到细胞脱落；将脱落细胞收集到相应的离心管里。

3）离心，将上清液吸出，但管内仍保留0.5ml上清液，然后用手指轻弹试管使单个细胞各自分散。

4）低渗：加入37℃预热的0.4% KCl与0.4%枸橼酸钠 1：1混合液 2ml，37℃低渗 20min。

5）预固定：加3：1的甲醇：冰醋酸固定液7滴预固定，离心，去上清。

6）固定：混悬细胞后，加新配制的上述固定液4ml，沿管壁逐滴加入并用手指轻弹。固定2次，每次20～30min。将离心管加盖后存放在4℃冰箱里≥30min。

7）滴片：滴片前必须用新鲜配制冷冻后的固定液更换一次。将玻片从水中取出，把一端放在纸上让部分水分流去，再用移液管将5～6滴细胞悬液均匀地滴在预冷玻片上。滴片时应注意保持移液管垂直向下，而将玻片保持一定角度。

8）干燥：离心留沉淀物混匀滴玻片上置烤箱数小时。在倒置显微镜下观察滴片质量，并标注患者姓名、实验室编号等。

同羊水细胞原位制片法。

同羊水细胞原位制片法。

绒毛细胞直接收获是收获细胞滋养层中的朗格汉斯细胞。朗格汉斯细胞在孕早期时自我分裂能力强，所以只需2～3h的处理就可以得到中期细胞以用于染色体分析。直接收获得到的细胞进行核型分析，对鉴别母体细胞污染和限制性胎盘嵌合体具有特别重要的参考价值，故在每一例绒毛细胞进行培养时都尽可能将其中的小部分进行直接收获处理。

在解剖镜下挑选和确认绒毛后，漂洗干净置入含秋水酰胺的生理盐水中（最终浓度为0.5mg/L）。

以1%枸橼酸钠（每毫升含0.5μg秋水酰胺）低渗30min。

用3：1的甲醇：冰醋酸固定液固定后，换固定液再固定30min以上。

用1：2：3的甲醇：水：冰醋酸液解离细胞10min，制成细胞悬液。

将细胞悬液滴于预冷的玻片上，用T型管均匀涂开。

在 60℃烤箱中烤片 12～24h。

同羊水细胞原位制片法。

同羊水细胞原位制片法。

绒毛细胞从经过酶处理后的绒毛组织中分离出来，绒毛核心中的间充质细胞可以在培养过程中分化，得到足量的中期细胞用于核型分析。

1）绒毛洗涤：将绒毛组织移至佩特里培养皿中，并在倒置显微镜下小心地将表面光滑的母源性蜕膜组织和血块清除干净，必要时可以用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤绒毛组织，用于长期培养。

2）绒毛培养：将供直接收获的绒毛放在盛有3ml经过预温的RPMI 1640培养液（含20%的小牛血清，1%庆大霉素）的培养皿里，然后放入CO ₂培养箱（箱内供应5%CO ₂，湿度为100%，温度为37℃）培养3h。

3）细胞生长同步化：向培养皿中加入0.1ml浓度为5～10mol/L的氟尿苷（FUDR）溶液，FUDR溶液的最终浓度为3.3× 10 ^-7mol/L，然后隔夜培养（约15h）。第二天早晨向培养皿中加入0.1ml浓度为10 ³mol/L的胸苷溶液，并使其最终浓度为3.3×10 ^-5mol/L。继续培养5h后，加入秋水酰胺（最终浓度为10mg/L），然后再培养1h。

4）收获：①用移液管将培养液从培养皿中吸出，再将经过预温的3ml浓度为1%的枸橼酸钠溶液加入培养皿，放回培养箱静置20min；②小心地将0.5ml固定液加入培养皿中，以终止低渗液的作用；③将固定/低渗混合液吸出，随后逐滴加入2ml新鲜配制的固定液，在加固定液的同时将培养皿轻轻来回水平摇动；④更换固定液一次，然后放在4℃冰箱中过夜。若急需结果，可以在更换固定液20min后滴片；⑤次日早晨将固定液吸出，稍等1～2min后，让固定液尽量蒸发；⑥视绒毛组织量的多少，加入100～200μl 60%的冰醋酸。在倒置显微镜下注意细胞从绒毛组织中分离的情况，同时轻轻摇动以利于细胞的分离。

5）用移液管将分离出来的细胞连同冰醋酸吸出，然后均匀地滴在经70℃预热的玻片上。冰醋酸在室温下会自动挥发。将玻片放在60℃电热板上隔夜干燥，然后显带染色。

注意事项：①用FUDR溶液对细胞进行生长同步化处理可以收获到较多的中期细胞，其染色体形态也较理想，缺点是占用时间较长。如果不使用同步处理，可以将绒毛组织放在培养液中37℃下培养1h，即可完成余下的低渗、固定以及冰醋酸处理等步骤，在当天收获。②在制片时可用移液管将绒毛在玻片上轻轻地来回拖动，这样可以分离出更多的细胞。

长期培养的时间为7～10d。绒毛组织由外层的滋养层细胞和内层的间充质核心组成。滋养层细胞体外培养时其分裂能力差，间充质核心包括纤维细胞、内皮细胞以及巨噬细胞。纤维细胞在体外培养分化能力强。

在长期绒毛细胞培养之前，必须首先把绒毛组织外层的滋养层细胞分离出去，然后将间充质核心中的细胞间物质分解以使纤维细胞分离出来。这个过程靠胶原酶的作用来完成。

1）清洗绒毛组织：操作与直接收获法相同。

2）将绒毛组织培养：绒毛组织加到盛有3ml 0.25%胰蛋白酶的培养皿中，然后放到培养箱中培养2h。将绒毛和培养液移至离心管内离心10min，除去上清液，将细胞团摇匀；加入7.5ml的Ⅳ型胶原酶溶液，再放回培养箱处理90min；离心后将细胞团轻轻打松，与培养液混合后种植到1个T型培养瓶和6个佩特里培养皿中的培养玻片上（与羊水细胞原位培养相同）。

3）换液：48h后加入培养液 1.5ml，以后每隔 48h 换一次培养液直到收获。

4）收获：收获操作程序与羊水细胞原位培养法相同。

5）染色：染色操作程序与羊水细胞原位培养法相同。

目前有多种染色体显带技术，其原理各不相同。显带的操作是一门艺术，其效果与实验室的条件、操作者的经验与手法关系密切。

应用C显带、核仁组织区（NOR）银染和荧光Q显带等准确识别有关染色体的正常多态性。

1）G显带：染色体标本经过胰蛋白酶处理后，再用吉姆萨染色，可使每条染色体上呈现出深浅交替的横纹。深染的带为含有A-T多的染色体片段，含G-C多的不易着色。每条染色体都有较为恒定的带纹特征。

2）R显带：同样用吉姆萨作为染料，但是应用不同的预处理方法而获得的与G带着色相反的带称为R带。

3）C显带：常用于确认双着丝粒染色体，检测额外标记染色体是否含有重要的遗传物质；1号、9号、16号染色体和Y染色体长臂常表现有多态性；此多态性可遗传，故可用于亲本来源的鉴定。

4）NOR银染：显示D组、G组染色体的NOR；银染的不是含有核糖体基因的染色体本身，而是其附近（随体柄区）与转录有关、有活性的蛋白质，可有数量和大小不同的多态性，有可遗传性。

5）Q显带：最早用于识别染色体结构的显带法。荧光素在染色体富含A-T的区带激发强的荧光，而在富含G-C的区带淬灭。染色体的染色质和蛋白质对Q带有重要影响。现常用于检测D组、G组染色体随体；3号、4号和Y染色体长臂染色质区的正常多态性。

在临床诊断实践中有很多的病例，需要有策略地综合应用以上各种技术，才能确认患者是否真正为染色体异常患者或是属于具有染色体的正常多态性变化。另外，各诊断实验室应该根据具体条件，同时参考别人的经验，摸索出适合自己的操作程序。这里介绍的是笔者多年来常用的几种显带程序。

1）外周血染色体G显带

常规消毒：外周血淋巴细胞培养前先用紫外线灯消毒培养操作台20min，全部操作在无菌条件下进行。

外周血淋巴细胞培养：取静脉血2～3ml置含肝素的无菌小瓶中，离心，取自体血清1ml（或1ml小牛血清），加RPMI 1640培养基4ml，加PHA 0.25ml。调节pH至7.2～7.4，再加入全血悬液6～7滴，置37℃恒温箱中培养72h。

秋水仙素：加入50mg/L的秋水酰胺，最终浓度0.1～0.2mg/L，37℃作用 0.5～1h。

低渗：将培养物离心，弃上清液后，加0.075mol/L KCl 6～8ml，37℃低渗处理 15min。

预固定：加3：1的甲醇：冰醋酸预固定，离心去上清液。

固定：用新配制的3：1的甲醇：冰醋酸固定液固定3次 ，每次 20～30min。

滴片：最后留沉淀物混匀，取部分滴至0～4℃的湿玻片上，立即置入60℃烤箱中烘烤数小时。

干燥：置玻片于37℃恒温箱中2～3d。

染色：0.24% EDTA和0.06%胰酶混合液处理1min左右，将玻片放在HBSS中洗涤两次；吉姆萨染液染色3～4min，将玻片用清水漂洗1次，然后让玻片上的水分在空气中蒸发掉，即制成G带标本。

诊断：油镜下计数30个分裂相，分析3个核型，作出染色体核型诊断。

异常时加大计数和分析量，必要时进一步做高分辨显带、C显带、R显带、NOR银染等特殊检查。

注意事项：在每次使用显带染色试剂前应先试染一张玻片，以确定各试剂使用时所需时间；为保证显带染色质量，应按照时间和染片的数量，定时更换胰蛋白酶及吉姆萨液；全部试剂均在室温下使用。

2）C显带实验方法

细胞培养：同常规方法。

收获：将玻片放入0.2mol/L盐酸溶液中室温下处理1h（0.83ml HCl加蒸馏水50ml）。蒸馏水冲冼，然后干燥。根据片龄长短，将玻片放入 5% Ba（OH） ₂溶液中，55～60℃水浴处理2～10min。应将盛有Ba（OH） ₂的广口瓶放在56℃水浴箱里以保持温度恒定。用蒸馏水冲洗玻片3次，随后过70%和95%酒精各一次，室温下晾干玻片。将玻片放在65℃ 2×SSC溶液（柠檬酸钠盐缓冲溶液）中孵育2h，用水浴箱保持温度恒定。

染色：用 5% 吉姆萨染色 10～15min。

注意事项：Ba（OH） ₂处理时间的长短会影响染色体的形态，时间过长则染色体变成空洞，过短则C带会分辨不清；Ba（OH） ₂容易与空气中的CO ₂结合并形成碳酸钡结晶，沉淀在瓶底或附于玻片上影响效果。因此，在Ba（OH） ₂处理过程中必须将瓶盖密封。

3）R 带实验方法

细胞培养：常规外周血培养72h。

收获：收获前6h加 5-溴 -2′-脱氧尿苷（BrdU）（最终浓度30mg/L），收获前0.5～1h加50mg/L的秋水酰胺1滴（5号针头），最终浓度为 0.1～0.2mg/L。

常规制片，玻璃片自然干燥7～10d。

玻璃片处理：将玻璃片放入pH 8.0，60℃的2×SSC液中（用1mol/L NaOH调pH），置紫外线灯管下10cm，垂直照射20min。

染色：冲洗干净后吉姆萨液染色。

4）NOR银染实验方法

细胞培养：常规培养。

收获：常规收获。

制片：取50%硝酸银（硝酸银5g，蒸馏水10ml）7滴加甲酸液1滴（甲酸0.1ml，蒸馏水50ml，用甲酸钠调pH至2.7）置于玻片上，在60℃水浴中处理1～2min。玻片变为棕黄色时，立即用流水冲洗干净。

染色：吉姆萨液染色。

5）Q显带实验方法

细胞培养：常规培养。

收获：常规收获。

制片：将玻片泡在盛有奎纳克林染液的广口瓶中避光放置10～15min；将玻片取出并用清水漂洗，洗去过多的奎纳克林染液；将玻片放在McⅡvaine缓冲液1min；在玻片上放置盖玻片，挤去多余的缓冲液和气泡。

读片：荧光显微镜下读片，进行核型分析（紫外线波长为 450～500nm）。

注意事项：因为染色体上的荧光在紫外线的照射下会逐渐消失，所以进行染色体分析时应尽量避免长时间操作；配备带有环状隔膜的镜头可以调节光线的强度，从而可以获得理想的对照，并且可以避免染色体过快褪色。

1）染色体脆性部位标本制作方法

培养基：可用MEM.MEM-FA或TC199培养基，一般用后可收到满意效果。试剂按说明配制，调节pH至7.6加入常规量PHA，加2%～5%小牛血清。

细胞培养：可根据不同需要加入不同诱导剂如BrdU、FUDR、甲氨蝶呤等。37℃培养96h。

常规收获制片，10%吉姆萨染色显带。

诊断：油镜下检测有脆性部位分裂相，记录坐标及位置，用简图标出，每例计数50～100分裂相。观察摄影后标本褪色。胰酶常规消化，染色。油镜下，按原坐标及草图所示脆点方位图进行定位分析。

2）姐妹染色单体交换方法

细胞培养：常规外周血培养24h。加入BrdU（最终浓度为10mg/L）继续培养48h。

收获：收获前0.5～1h加入秋水酰胺，最终浓度为0.1～0.2mg/L。

制片：常规制片，37℃放置1d。玻片浸泡在60℃2×SSC液中，置紫外线灯管下10cm处，照射30min。

干燥：自来水冲洗，晾干。

染色：吉姆萨液染色。

3）G带高分辨实验方法

细胞培养：用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液5ml加 PHA 0.25ml，pH 调至 7.2，加全血 6～8 滴，在 37℃温箱中培养72h。加入胸腺嘧啶核苷最终浓度0.3mg/ml继续培养17h。离心后弃上清液，加入RPMI 1640培养液混匀后再次离心弃上清液。将细胞放入含20%小牛血清的RPMI 1640培养液5ml中（pH 7.0）培养4h。加入放线菌素D（最终浓度6mg/L）培养1h。取0.5mg/ml的放线菌素D，5号针头加6滴。

收获：秋水仙素作用：加50mg/L的秋水酰胺2滴（5号针头）培养15min。

低渗：用 0.4% KCl和 0.4% 枸橼酸钠（1：1）8ml低渗15min。

预固定：加3：1的甲醇：冰醋酸固定液1ml预固定。

固定：加3：1的甲醇：冰醋酸固定两次，每次10min。

玻片老化：用湿冷玻片，立即放入60℃烤箱中烤干。

染色：显带方法同G显带常规。

产前筛查及产前诊断工作关乎一个胎儿的生命健康和今后的生活质量、一个家庭的幸福与今后的生活状态，甚至影响整个国家人口素质，影响经济社会的健康可持续发展，责任重大。产前筛查与产前诊断技术伴随着医学及生物学技术的发展，技术方案不断更新，诊断水平日益提高。在当前国内外产期筛查与诊断方案、技术繁多的情况下，可根据本地区的医疗技术水平、经济发展水平等因素进行取舍，选择最适宜本地区的产前筛查与诊断方案，并在发展中不断优化、提高，借助不同的诊断技术，快速、准确识别有缺陷的胎儿，实现我国人口素质的全面提高。

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