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二、痰涂片镜检
痰涂片镜检包括萋-尼氏染色镜检方法和荧光染色方法，用于检测痰标本中存在的抗酸杆菌。初诊患者应收集三份痰标本进行痰涂片镜检。
（一）操作步骤
1.痰涂片的制备
（1）用于痰涂片检查的载玻片要求
1）一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。
2）使用一端有磨砂面的无划痕新玻片，经95%乙醇擦拭（或浸泡）脱脂或使用脱脂的载玻片，在玻片一端的1/3处用2B铅笔注明实验室序号及标本序号。
（2）制备涂片
1）在生物安全柜内小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。
2）仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml，于玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10mm×20mm卵圆形痰膜。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色镜检。
3）涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。
4）为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热。
2.萋-尼氏染色法
（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上，火焰固定（在5秒内将玻片置于火焰上烤4次）。
（2）滴加石炭酸复红染液盖满玻片，火焰加热至出现蒸汽后脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
（3）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
（4）自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟。如有必要，须流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
（5）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
（6）滴加亚甲蓝复染液，染色30秒。
（7）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
（8）染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，若透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片涂抹过厚。
3.荧光染色法
（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上。火焰固定（在5秒内将玻片置于火焰上烤4次）。
（2）滴加金胺O荧光染色剂盖满玻片，染色10～15分钟。流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。
（3）痰膜上端外缘滴加脱色剂，盖满玻片，脱色3分钟或至无色，流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。
（4）加复染剂复染1分钟，沥去复染液，流水自玻片一端轻洗，自然干燥后镜检。
4.镜检
（1）萋-尼氏染色法：
使用10×目镜的双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察。
（2）荧光染色法：
玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以10×目镜、20×物镜进行镜检，发现疑为抗酸杆菌的荧光杆状物质，使用40×物镜确认。在暗背景下，抗酸杆菌发出黄色荧光，呈杆状略弯曲。
（二）操作注意事项
1.试剂质量的确认
对于自己配制或商品化的染色试剂均要监测染色液的质量，每次制备或购买一批新的染色液之后，须使用未经染色的已知阳性和阴性涂片进行染色、镜检，并记录结果。并在效期内使用，严禁使用过期的染色试剂。
2.痰膜制备
选取痰标本中脓性、干酪性部分制备痰膜（图3-2）。
图3-2 选取痰标本中脓性、干酪性部分（A点显示部位）
制备适宜厚度的痰膜，将已涂抹痰膜并干燥的玻片放置在报纸上，若透过痰膜不能分辨报纸上的5号字则表明该玻片涂抹过厚，若透过痰膜能够非常清晰地辨别报纸上的字则表明痰膜涂抹过薄（图3-3）。
图3-3 痰膜涂抹的厚度示意图
3.染色
萋-尼氏染色要进行热染，相比冷染可以提高阳性检出率。
要保证足够的染色时间，萋-尼氏染色方法初染液加热出现蒸汽后保持5分钟，荧光染色方法初染液染色至少15分钟。
每批染色时要加入1张阳性和1张阴性涂片作为质控片对染色过程及染色剂进行质量控制。
萋-尼氏染色镜检的涂片肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块（见图3-4）。荧光染色涂片呈黄色。
图3-4 萋-尼氏染色后呈均匀亮蓝色
4.镜检
确保显微镜的功能正常。
按照结果报告标准仔细观察足够的视野数，萋-尼氏染色方法镜检时，首先应从左向右观察相邻的视野。当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。
通常20mm的痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100个视野。仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上。报告1+时至少观察300个视野，报告2+时至少观察100个视野，报告3+、4+时至少观察50个视野。荧光染色方法镜检报告阴性、实际条数、1+、2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。
镜下寻找含有大量炎性细胞存在的区域，若仅观察到含有上皮细胞的区域往往不能检出抗酸菌（图3-5）。
视野-1
视野-2
图3-5 痰涂片镜检镜下视野
（三）监控质量指标
每月定期汇总分析反映痰涂片镜检工作的质量指标，连续监测各指标，指标值出现明显变化应立即查询原因，并尽快解决（图3-6、图3-7）。
痰涂片镜检质量指标包括初诊患者痰涂片镜检阳性率、初诊患者涂片中低阳性级别（实际条数/300视野、1+）结果比例、随访患者痰涂片镜检阳性率、痰涂片镜检周转时间等。
初诊患者痰涂片镜检阳性率=初诊患者痰涂片镜检阳性片数量/初诊患者痰涂片镜检片总数量
初诊患者涂片中低阳性级别结果比例=初诊患者低阳性级别（实际条数/300视野、1+）结果的痰涂片数量/初诊患者阳性痰涂片总数量
随访患者痰涂片镜检阳性率=随访患者痰涂片镜检阳性片数量/随访患者痰涂片镜检片总数量
痰涂片镜检周转时间=自实验室收到痰标本后至实验室报告痰涂片镜检结果的时间间隔
图3-6 抗酸杆菌涂片镜检标准化操作示意图（萋-尼氏）
图3-7 抗酸杆菌涂片镜检标准化操作示意图（荧光）