03　不容忽视的“抗菌药物耐受”群体——持留菌

抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）是当今面临的最为重要的科学性挑战之一。如何应对AMR？需要深入认识宿主-病原体间的关系以及它们在传播、感染及疾病过程中的演变，同时也需要深刻理解病原体与宿主体内和环境生态系统中其他微生物间的相互作用。在人类不断与病原体进行抗争的过程中，我们不能忽视一个特殊的群体——持留菌。

持留菌是存在于机体内的一群比例极低的特殊群体，可表现为高度多药耐受，其与慢性感染之间存在着密切的关系，是临床微生物感染治疗和防控的主要阻碍之一。持留菌针对抗菌药物和机体免疫系统形成了一系列复杂而行之有效的免疫逃逸机制，可成功逃避免疫系统的清除，与宿主免疫应答保持动态平衡而在机体中存活。当机体免疫力下降如营养不良、老龄化、应用免疫抑制剂及糖皮质激素时，持留菌重新繁殖，继而引起感染性疾病的复发和病情加重。面对细菌持留现象，我们需要将关注点从基本的表象转移到在抗菌药物压力下持留菌得以存活的基因、生理、代谢机制上来，目前由于缺乏对持留菌进行严格鉴定、区分的生物标志物，关于持留菌仍然有很多未知的领域值得探索。

一、持留菌研究历史回顾

持留菌的概念是Joseph Bigger于1944年首次提出。他在研究青霉素药效动力学时发现，将致死剂量青霉素添加到葡萄球菌培养基中作用后，有一小部分细菌仍能存活，但这些细菌并不是耐抗菌药物的突变株，因此，他将这部分存活细菌定义为持留菌（persisters），将这一现象称为持留现象（persistence）。随后，研究学者用大肠埃希菌重复试验，也得到相似结果。目前已经明确，包括葡萄球菌在内的所有细菌几乎都存在这种现象。从20世纪40年代到20世纪60年代，持留现象发现之后数十年时间内，新型抗菌药物不断面世并大量应用到临床，使感染性疾病的治疗难度下降，并且随着人们对新的疾病的认识不断加深，关注点从感染性疾病转向慢性疾病和肿瘤等领域，持留菌研究很长一段时间进展缓慢。直到1983年，Harris Moyed和Bertrand将反复暴露在青霉素中的大肠埃希菌剔除基因突变耐药菌，筛选出持留菌，鉴定出首个与持留相关的基因——hipA7等位基因。然而hipA敲除实验并没有改变大肠埃希菌表型，不能证明野生型持留菌的形成与hipA有关，这一研究思路也停留于此。从20世纪90年代开始，耐药菌群的发生速度超过新的抗菌药物研发，而且随着人体介入诊疗的广泛应用，肿瘤化疗、异体移植、HIV感染等免疫功能缺陷患者的不断增加，潜伏感染、慢性感染及多重耐药日益成为一个严峻的临床问题，与慢性感染存在着密切联系的持留菌又重新成为研究的热点。

二、持留菌的特性

国内外研究者对持留菌的普遍共识是：它是一类随机形成、处于静止或休眠状态的细菌，普遍对抗菌药物敏感性低，亦称为“药物不应答”。虽然同样是对抗菌药物具有耐受作用，持留菌与细菌的耐药性具有本质区别。传统意义上的耐药菌有遗传物质基础，源自耐药基因的突变，产生改变药物作用的靶点或者灭活抗菌药物的酶，MIC值上升并在抗菌药物的存在下可以继续增殖。持留菌是指处于抗菌药物或恶劣生存环境压力作用下时细菌大多数死亡，极小部分处于既不增殖也不死亡的休眠状态的细菌小亚群。它们能够耐受抗菌药物作用，MIC并没有改变，环境压力解除后，持留菌恢复对抗菌药物敏感，整个过程只发生表型突变并可逆，称为高持留突变，也称之为“抗菌药物耐受”。

三、持留菌的持留机制

随着持留菌研究的深入，已发现多种机制参与持留菌形成，其中获得普遍认可的机制有以下几种。

持留菌所表现出的对抗菌药物的耐受性，与生物被膜的形成有很大的关系。生物被膜是有一定结构，形成过程可逆的一类包膜，对抗菌药物的杀伤具有很强的抵抗能力。它主要是由细菌及其分泌的多糖蛋白复合物、纤维蛋白、脂质蛋白以及周边沉淀的有机物和无机物等相互包绕而形成的聚集膜样物，可以大大提高微生物抵御外界恶劣环境的能力。一般认为，慢性感染伴随着生物被膜的形成，并与牙齿疾病、心内膜炎、尿路感染、机体深部感染、留置设备和导管相关感染以及难治性囊性纤维化有关联。

生物被膜严格意义上来说并不完全阻断抗菌药物的渗透，而是在细菌和免疫系统的大分子之间形成屏障。但是生物被膜内的大部分细菌都容易被抗菌药物杀灭，只有小部分存活。基于这些发现，研究者对疾病复发机制提出一种假设：抗菌药物杀死大部分细菌，免疫系统清除来自血液中的一般细菌，存活下来的就是生物被膜里的持留菌。当抗菌药物撤退，持留菌重新从被膜中释放，造成疾病复发。生物被膜不仅为持留菌逃避免疫应答提供庇护，还能在持留菌耐受化学杀伤时发挥关键作用。持留菌在抗菌药物难以深入的组织中持续存在，引发脑脓肿、脑膜炎等，研究还发现难根治的幽门螺杆菌与胃肠道炎症和癌症的发生有关。

从基因水平上，最直接的研究持留菌复杂功能机制的方法是构建转座子文库，通过筛选产生的一系列基因，可以研究持留菌的鞭毛、趋化性、毒力等功能。

研究发现的第一个与持留水平相关的基因是大肠埃希菌中的hipA7等位基因，该基因携带2个点突变，使细菌对包括破坏细胞壁、参与DNA损伤相关的氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物耐受。但通过对大肠埃希菌中转座子插入文库的筛选，并没有一个基因在表型变异上得到验证。这意味着单一表型对应的单一机制模式的研究思路可能存在问题。由此，科学家提出另外一种假设，各种错配的蛋白质的随机生成可能是持留菌形成的原因。大肠埃希菌中的DnaJ和沙门菌种的酶类蛋白PmrC都是具有毒性的蛋白，能抑制细胞生长造成多重耐药，但是这种假说与持留菌形成的动力学相矛盾。细菌生长的对数期早期持留菌的数量少，然后在中期急剧升高，通过不断重新培养将细菌始终保持在对数生长期早期，将检测不到持留菌的存在。也就是说，持留菌的形成可能遵循某种严格的规律而不是由蛋白质随机错配造成。总之，Mori研究小组进行的转座子文库的研究工作目前为止还需要完善，包括还需要找到某种确切的介导表型变异的基因或者进一步丰富转座子文库。

另一方面，目前通过转座子文库找到的持留相关基因都是全局性调节因子，包括DksA、DnaKJ、HupAB和IhfAB，这些全局性调节因子通过调控几个持留基因的表达来产生持留表型。筛选的基因如YgfA、YigB可能直接影响持留菌的形成，它们通过消耗黄素单核苷酸来阻碍细胞代谢活动。同样的方式在铜绿假单胞菌中也存在某些相应基因，也不具有表型变异。这些实验可能表明，持留菌的形成不取决于单一细胞功能或单一通路来实现，而是存在多种机制的相互作用。

TA系统在细菌线粒体中较为常见，少数存在于染色体，但它的大部分功能目前尚未阐明。TA系统中，毒素蛋白能抑制一系列重要细胞功能包括转录、复制，并与抗毒素蛋白结合形成无活性的复合物。毒素蛋白较稳定，而抗毒素能够降解。若子代分裂以后没有获得含这种TA的质粒，随着抗毒素的降解，毒素蛋白就能将细胞杀死或者抑制其增殖。染色体中的TA功能未知，大肠埃希菌中MazEF染色体被认为是参与细菌死亡的机制。但最近研究显示，实际上MazEF与其他一些毒素蛋白RelE并不直接介导细菌的程序性死亡，而是通过抑制转录活动将细菌诱导为静止状态，一些抗毒素蛋白得以保存。敲除TA系统的hipBA基因不能影响持留菌的生成。国内外目前形成一个共识：hipA7等位基因能表达一些未知的特定产物来干扰与持留菌形成有关的物质，进一步研究hipA的作用或许能够揭示TA系统与持留菌状态的关系。

持留状态下细菌的功能受到抑制，代谢在这个过程中起着重要作用。研究表明，编码代谢酶与调控因子的基因的波动能够改变持留水平。

研究者还发现，突变造成的微小氨基酸代谢能够显著影响持留菌的形成。通过筛选大肠埃希菌转座子文库定位了对替卡西林持留水平提高的18个突变，其中16个与氨基酸的生物合成有关。在对铜绿假单胞菌的研究中，也发现对细菌持留有重要作用的现象——氨基酸代谢的中断。活化赖氨酸脱羧酶的PA4115突变，增加对羧苄西林的持留耐药，而参与氨基酸新陈代谢的pheA突变，发现可以提高持留水平。这些研究表明，氨基酸代谢是持留菌形成的一个关键的因素。进一步研究提示，鸟苷四磷酸在持留状态中起主导作用，鸟苷四磷酸和转录调节因子DksA对持留菌的代谢具有全局性的调节作用。

四、研究展望

目前为止，虽然持留菌领域的研究不断取得进展，但持留菌形成的机制尚未清晰阐明。限制持留菌研究的一个主要原因是体外培养，通过外在的抗菌药物压力只能提高持留比例，并不能将持留菌与非持留菌绝对分离，尚无特异性生物标志物来对两者进行区分。另外，目前的研究工作还存在一些争议。比如，传统观点认为持留菌几乎是不分裂的，但McKinney研究小组发现，微液态培养环境下延时观察异烟肼作用的耻垢分枝杆菌存在一定规模的分裂增殖活动，与细菌的死亡形成一种动态平衡，将持留菌的数量维持在一个稳定的水平。传统的研究持留菌的手段是取某一连续状态下的持留菌进行研究，而缺乏对持留菌瞬时状态的实时监测，造成以往对持留菌的休眠、静止状态的界定和区分存在不确定性。随着技术的发展，将荧光技术和微流控技术联合应用，可以实现对单个细菌的生理状态的实时观察和监测，为持留菌的研究提供了更为直观的手段。

最新的研究证据多将持留机制与生物被膜联系起来。明确生物被膜对持留菌耐药的重要机制，尚需要构建大量的体内和体外实验模型进行深入研究。在持留菌感染的临床治疗和研究进展方面，有研究者很早以前就提出了简单的消灭持留菌的方法，即间断脉冲给药方案：先用大剂量抗菌药物杀灭细菌，然后降低抗菌药物浓度，使持留菌恢复生长。如果第二次大剂量抗菌药物紧跟在持留菌恢复生长之后，就有可能将所有细菌全部清除。这种治疗策略在体外实验是成功的，但在临床实际应用中却很难实现。另外，Collins等发现庆大霉素协同葡萄糖、甘露醇、果糖或丙酮酸盐能快速杀死大肠埃希菌和葡萄球菌持留菌株。目前尚无特异靶向的对机体持留菌进行绝对清除的药物或者治疗方案，合适的代谢产物与抗菌药物协同作用的研究可能是解密持留菌的一个突破口。

五、结语

近年来，基因组学、蛋白质组学等临床分子生物学技术的迅猛发展，持留菌的研究手段从早期的培养到基因测序，并借鉴与结合细胞代谢机制、微生物感染免疫信号通路、基因突变耐药等最新研究方法与研究思路，持留菌的机制研究从单一走向多元，为这一领域的研究工作带来了更多有益的研究启发。但是由于环境压力下的细菌菌群的高水平持留突变亚群的表型特征具有一过性与随机性，并且难以从表型对菌株进行分离与筛选，使得持留菌的研究面临着巨大的障碍。介导持留菌形成的信号调控网络原理的阐述还存在很多无法明确的地方。大多数研究者认为，在细菌的基因突变耐药的产生过程中，持留菌或许扮演着积极的作用。遗憾的是，持留菌表型突变与传统意义上的基因突变耐药的确切关联和内在联系尚未被研究者证实。临床上，在治疗处于持留状态的细菌感染时，多数仍然采用传统的经验性联合用药或者大剂量用药、间隔给药的方式，尚未对持留菌的持留特性进行有效并有针对性地治疗，新的治疗靶点及新型药物也亟待研发。

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