2.2　纳米级红外光谱及成像技术

随着材料和生物医学等学科的发展，对微米尺度以下的化学组分的分析越来越受到重视，比如微米级的层状结构、纳米纤维、改性聚合物、有机无机杂化材料、有机太阳能电池、金属有机骨架（MOF）材料等［20-22］。对于化学组分分辨率的期望一般是低于100nm，理想情况是数十纳米。目前共聚焦拉曼可以实现亚微米级的化学成分分析，实际分辨率一般为700nm～1μm，但由于拉曼信号较弱，加上背景荧光较强，所以应用范围受到限制。而针尖增强拉曼光谱（TERS）虽然可以实现10nm化学分辨率，但由于拉曼信号弱、针尖要求特殊、对实验人员的操作技能要求高以及数据结果重复性低等大大限制了其应用。传统的FTIR的空间分辨率限制于衍射极限，通常情况下，空间分辨率的局限性大概是传统发射波长的3倍，或者使用衰减全反射（ATR）的方式，可以将其空间分辨率接近于其辐射波长，在C—H伸缩振动区域，大约相当于3～10μm。

新型QCL的采用可显著提升传统的傅里叶变换红外显微成像技术。例如，Agilent 8700 LDIR激光红外成像系统将QCL与快速扫描光学元件相结合，仅需测量几个关键波长，即可得到大面积的高分辨率图像，从而节省时间和成本。在ATR模式下，可选择小至0.1μm的像素分辨率。在制药领域，该系统可获得有关活性药物成分、赋形剂、多晶型、盐类和缺陷的有用信息，以便能够快速找出并解决药物开发过程中遇到的问题，保证不同生产批次之间具有良好的一致性。除了在药物分析中的应用外，该系统还可用于层压材料、生物组织、聚合物和纤维材料的成像分析。例如，已有报道用QCL红外显微镜替代傅里叶变换红外显微成像技术进行无标记的癌症组织分类，该技术也可用于生物标志物搜索。

纳米级红外光谱系统（Nano-IR）通过利用原子力显微镜（AFM）与IR联合的方式来表征材料，AFM的工作方式有点像唱片机针，它在材料表面上移动，并在提升和下降时测量最细微的表面特征。Nano-IR使IR的空间分辨率突破了光学衍射极限，提高至10nm级别，典型的光学空间分辨率约为20nm，在得到微区形貌、表面物理性能的基础上，进一步解析样品表面纳米尺度的化学信息。Nano-IR目前主要有两种实现方式：一是基于光热诱导共振现象开发的原子力显微-红外光谱（AFM-IR）技术，另一种是基于针尖近场散射的扫描近场光学显微（Scattering-type Scanning Nearfield Optical Microscopy，s-SNOM）技术。两种技术都能实现微区的光谱信号采集和成像，从而获得化学成分信息［16，23-25］。

AFM-IR也称光热诱导共振技术（Photothermal Induced Resonance，PTIR），利用一个脉冲和可调的红外源去激发样品的分子吸收，脉冲频率为千赫兹数量级，可达几十或者几百千赫兹，红外光束通过像传统的ATR光谱类似的全内部反射的方式照射到样品上。如图2-5所示，当样品吸收到辐射时，会在极短的时间范围内（通常为几百纳秒）产生热膨胀，膨胀变形量在亚纳米级别，产生的热膨胀会使该区域产生快速的热膨胀脉冲。这个热膨胀脉冲会激发AFM针尖的悬臂的共振，且悬臂的振幅正比于样品的吸收系数，即热膨胀能被AFM的光电二极管测量系统检测到。通过傅里叶技术分析提取振动的振幅和频率，然后建立振幅与激励波长的函数关系，就可以获得针尖下方微区内的红外光谱，所得到的谱图与传统红外光谱仪得到的谱图一致。AFM-IR纳米级红外技术主要依赖于样品的吸收系数ks，与针尖和样品的其他光学性质基本无关，因此该技术尤其适合具有较高热膨胀系数的软物质材料，如高分子聚合物、复合材料、蛋白和细胞、纤维、多层膜结构、药物、锂电池等的纳米尺度的化学成分鉴定、组分分布及相分离结构、表界面化学分析和失效研究等方面。

图2-5　AFM-IR纳米级红外光谱获取示意图

s-SNOM是一种在纳米级别探测物质与光的近场作用（Light-matter Nearfield Interaction）的表面表征技术。如图2-6所示，在s-SNOM技术中，一束特定波长的光被聚焦在AFM的探针上，金属或带有金属涂层的AFM探针被用来加强和散射样品表面附近的近场光场，因此散射光包含了丰富的探针-物质近场相互作用的信息。在被远场（Far-Field）的光检测器检测到后，经过一定的信号处理，散射光可以被用来表征在AFM探针下的样品的光学特性。这些散射光的信息包括光的振幅和相位，通过适当的模型，这些测量可以估算出针尖下样品纳米尺度区域材料的光学常数（n、k），而且光学相位与波长还可提供与同种材料常规吸收光谱近似的光谱信息。s-SNOM技术，其应用受到样品限制，只有对红外线有较强散射的样品才能得到信号，而且散射信号复杂，必须有模型进行修正，得到的IR的波数也有漂移，使得结果的显示不够直接。但s-SNOM技术特别适用于硬质材料，特别是具有高反射率、高介电常数或强光学共振的材料。

图2-6　s-SNOM纳米级红外光谱针尖扫描样品示意图

F.Huth等将Nano-FTIR应用到对纳米尺度样品污染物的化学鉴定上，图2-7中显示的Si表面覆盖聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）薄膜的横截面AFM成像图，其中AFM相位图显示在Si片和PMMA薄膜的界面上存在一个100nm尺寸的污染物，使用Nano-FTIR在污染物中心获得的红外光谱清晰地揭示出了污染物的化学成分，与标准FTIR数据库中谱线进行比对，可以确定污染物为聚二甲基硅氧烷（PDMS）颗粒［26］。

图2-7　Nano-FTIR用于纳米级污染物的化学组成鉴别

S.Gamage等利用纳米级红外光谱成像技术，揭示如艾滋病病毒（HIV）、埃博拉病毒及流感病毒等包膜病毒（Enveloped Viruses）在入侵宿主细胞前进行的关键性结构变化。他们发现了一种抗病毒化合物，能有效地阻止流感病毒在低pH值暴露期间进入宿主细胞，低pH值环境是病毒引起感染的最佳条件。该方法提供了关于包膜病毒如何攻击宿主的重要细节，以及预防这些病毒攻击的可能方法［24］。

我国科研人员也利用纳米级红外光谱技术开展了相关的研究工作［25-28］。例如，唐福光等利用纳米AFM-IR对高抗冲聚丙烯共聚物材料个三种不同微区组分进行分析，这些信息有助于理解聚合反应动力学与颗粒生长机理和催化剂的优化设计。史云胜等通过Nano-IR分析发现石墨平台表面具有非常有序的碳六元环结构，并且吸附的水分子最少。而石墨平台微结构的边缘由于悬键及微加工等原因是吸附水分子最多的位置，石墨基底由于微加工的破坏已经不具有碳六元环结构。这些信息明确了所处环境对石墨平台微结构不同位置的影响，为指导微机电器件的制备与应用提供了信息。韦鹏练等应用Nano-IR技术研究了竹材纤维细胞壁的化学成分及其分布，观察到了木质素在细胞壁中具有团聚状的不均匀分布。

AFM除了与IR联用以外，还可与其他光谱相结合，例如AFM与拉曼光谱仪联用的针尖增强拉曼散射（Tip-enhanced Raman Scattering，TERS）光谱技术，目前最佳的光学空间分辨率可达0.5nm；AFM与太赫兹（THz）光谱技术联用的散射式的近场太赫兹（Scattering-type Scanning Near-field THz Spectroscopy，S-SNTS）光谱技术；目前最佳的光学空间分辨率为40nm。TERS、Nano-FTIR与S-SNTS三种技术的基本原理类似，都是依赖于探测在金属化探针针尖尖端形成的、与针尖曲率半径大小相当的纳米级增强光源与待测分子之间的相互作用，来获得纳米级的光学空间分辨率［29，30］。

此外，如图2-8所示，同步辐射（Synchrotron）作为另一种新型的红外光源，具有光谱宽（10～10000cm－1）、亮度高（比传统Globar光源高2～3个数量级）、小发散角等特性，特别是其高亮度的特性十分适合开展红外显微光谱成像研究，在小样品或小样品区域的表征方面具有传统IR无法比拟的优势。随着同步辐射红外显微光谱技术的发展，已经将研究的重点从组织层次的IR成像扩展到细胞层次的IR成像，并在近十年的研究中取得了可观的研究成果，在细胞的结构和功能研究中以及其他领域（文化遗产、考古学、地球和空间科学、化学和高分子科学等）不同材料的研究中都会逐步显示出独特的作用［31-34］。

图2-8　SINS系统示意图

如图2-9所示，C.Y.Wu等在Nature上发文，他们使用基于同步辐射红外纳米光谱（Synchrotron-radiation-based Infrared Nanospectroscopy，SINS），成功研究了结合在催化剂颗粒上的N-杂环卡宾分子的化学转化，空间分辨率达25nm。研究人员由此可以分辨具有不同活性的颗粒区域，结果表明，与颗粒顶部的平坦区域相比，包含低配位数金属原子的颗粒边缘的催化活性更高，能更有效催化结合在催化剂颗粒上的N-杂环卡宾分子中化学活性基团的氧化和还原［35］。

图2-9　SINS用于研究催化剂颗粒上的N-杂环卡宾分子化学转化示意图

光热诱导亚微米红外成像技术采用AFM-IR光热技术的基本概念克服红外波长衍射极限的限制，具有亚微米级空间分辨率，空间分辨率可达500nm，可获得亚微米尺度下样品表面微小区域的化学信息，如图2-10所示。该技术通过脉冲式中红外激光器照射样品表面，产生光热效应，被聚焦到样品上的可见光作为“探针”进行检测［36］。光热诱导亚微米红外成像技术可在反射模式下进行样品测试，无需制备薄片，适用于厚样品，提高了样品测试效率，可为聚合物、生命科学（骨头、细胞、头发等）、复合药物样品及微电子器件的有机缺陷和污染物等提供亚微米尺度的IR和成像检测［37，38］。

图2-10　可实现亚微米级空间分辨率下的IR和成像示意图

2017年美国PSC公司开发出商品化的mIRage光热诱导亚微米红外成像仪，填补了传统IR显微镜和Nano-IR之间的空白，该产品还可实现红外和拉曼分析的一体化，共同检测有机、无机组分，可大大拓展该技术的应用领域。