第三节　心肌损伤的酶学标志检测方法

一、肌酸激酶及其同工酶

（一）肌酸显色法测定肌酸激酶总活性

1.原理 磷酸肌酸和二磷酸腺苷（ADP）在肌酸激酶（creatine kinase，CK）催化下，生成肌酸和三磷腺苷。肌酸与二乙酰（2，3-丁二酮）及α-萘酚结合生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌酸量成正比，据此求得血清中CK活性。Mg²⁺为激活剂，半胱氨酸供给巯基，氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并中止反应。

2.主要试剂

（1）混合底物溶液：预先配制Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、12mmol/L磷酸肌酸溶液（-25℃保存）、4mmol/L ADP溶液（-25℃保存）。临用前将三溶液等量混合，然后按每9mL混合液中加入盐酸半胱氨酸31.5mg，调pH值至7.4，置-25℃或冰盒中保存，可用1周。若空白管吸光度太高，表明有游离肌酸产生，不能再用。

（2）配制沉淀剂：50g/L硫酸锌溶液和60g/L氢氧化钡溶液。

（3）配制显色剂：先配制碱储存液（含NaOH 60g/L和Na₂CO₃128g/L），临用前再以碱储存液为溶剂配制40g/Lα-萘酚溶液；配制10g/L的2，3-丁二酮溶液作储存液，临用前蒸馏水作20倍稀释。

（4）配制1.7mmol/L肌酸标准液，在冰箱保存可用数月。

3.操作步骤 肌酸显色法测定CK操作步骤见表3-2。

单位定义：1mL血清在37℃与底物作用1h产生1μmol肌酸为1个CK活力单位。若将此单位乘以1000/60（或16.7），即为国际单位（U/L）。

计算公式如下：CK单位=（测定管吸光度/标准管吸光度）×标准管中肌酸含量（μmol）×[1/反应时间（h）]×[1/样品量（mL）]=（测定管吸光度/标准管吸光度）×3.4

4.参考范围 成人血清：8～60U/L。

5.评价

（1）肌酸与α-萘酚溶液及2，3-丁二酮产生红色化合物的反应并非肌酸所特有，精氨酸、胍乙酸及肌酐均可起反应。在肾衰竭及某些代谢病时，此类物质含量较高，应注意做血清空白对照。实验所用α-萘酚应为白色或略带黄色之结晶，如颜色过深，应在乙醇中重结晶后再用。

（2）本法的线性范围在200U/L，当血清CK活力超过200U/L时，需用已知较低CK活性的血清稀释后再做，经计算得出结果。如用生理盐水稀释，CK活性将随血清稀释倍数的增加而增加，因为血清中存在内源性的抑制剂。

（二）酶耦联法测定总CK

1.原理 在CK的催化下，磷酸肌酸与ADP反应生成肌酸和ATP；随即在己糖激酶（HK）催化下，生成的ATP使葡萄糖磷酸化为6磷酸葡萄糖（G-6-P）；再在6-磷酸葡萄糖脱氧酶（G₆PDH）催化下，G-6-P与NADP⁺反应，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH；在340nm波长下，监测NADPH的生成速率，即代表总CK活性。反应过程如下。

2.主要试剂 由试剂盒提供，各厂家试剂盒可能会略有不同。试剂1主要含咪唑缓冲液（pH 6.7）、D-葡萄糖、醋酸镁、五磷酸二腺苷、N-乙酰半胱氨酸、己糖激酶、G₆PDH、ADP、AMP、NADP⁺等（N-乙酰半胱氨酸供给巯基，保持CK活性中心必需基团不被氧化；Mg²⁺作激活剂；血清中Ca²⁺是Mg²⁺的竞争性抑制剂，EDTA可消除Ca²⁺的影响，且有利于试剂的稳定；AMP和五磷酸二腺苷可抑制腺苷酸激酶的活性）。试剂2为磷酸肌酸。

3.操作步骤

（1）以半自动分析仪为例，操作如下。

①取2mL试剂1与100μL血清置测定管中，混匀，37℃水浴5min。

②加入500μL已预温的试剂2，混匀，移入比色杯中，立即放入37℃恒温比色槽。

③待延滞时间150s后，在340nm波长处，连续监测吸光度变化速率（读数时间150s），以线性反应期吸光度的增加速率，计算血清中CK的活性。

（2）如为自动分析仪上机操作，则严格按说明书要求设置参数。

4.计算 CK（U/L）=ΔA/min×10⁶/6220×26=ΔA/min×4180

式中，6220为NADPH在340nm的摩尔吸光度，26为反应液总体积与血清用量的比值。ΔA/min为平均每分钟吸光度变化值。

5.参考范围 ①成年男性血清参考范围为38～174 U/L；②成年女性血清参考范围为26～140 U/L。

6.评价

（1）酶耦联法测定血清肌酸激酶活性灵敏、快速，为IFCC推荐方法。

（2）最好采用血清标本，勿用柠檬酸盐、EDTA和氟化物作抗凝剂，否则会影响测定结果。黄疸和高脂血症可干扰测定。

（3）红细胞中虽不含CK，轻度溶血对测定无影响，但中度和重度溶血时，红细胞释放的腺苷酸激酶（AK）可催化2ADP→ATP+AMP，红细胞中还会释放ATP及6-磷酸葡萄糖等干扰测定，影响结果。其余同肌酸显色法评价（2）。

（三）免疫抑制法测定肌酸激酶MB同工酶

1.原理 预先加入抗肌酸激酶M亚基抗体，完全抑制CK-MM和半抑制肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）的活性，在后续反应中，仅肌酸激酶B亚基催化磷酸肌酸与ADP的反应。其后续反应及测定原理同前述的酶耦联法测定总CK。但测得的是肌酸激酶B亚基的活性，结果乘以2即为CK-MB的活性。

2.主要试剂 由试剂盒提供，各厂家试剂盒可能会略有不同。试剂1主要含咪唑缓冲液（pH 6.5）、葡萄糖、醋酸镁、五磷酸二腺苷、N-乙酰半胱氨酸、己糖激酶、G₆PDH、ADP、AMP、NADP⁺、抗肌酸激酶M亚基抗体等。试剂2主要为磷酸肌酸、咪唑缓冲液（pH 8.5）。

3.操作步骤 按说明书要求设置参数，上全自动生化分析仪进行测定。

4.计算 计算公式同酶耦联法，所得结果为CK-B（U/L）。

CK-MB（U/L）=CK-B（U/L）×2

5.参考范围 成人血清参考范围为0～10U/L，或CK-MB活力占总CK活力的5%以内。

6.评价

（1）本法是假定标本中无CK-BB或CK-BB活性极低，若某些疾病致CK-BB异常升高，则可使CK-MB测定结果假性偏高，有的甚至高于CK。

（2）CK-BB（免疫球蛋白复合物）会被当作B亚基测定，如CK-MB的活性超过总CK活性的20%，应怀疑有CK-BB存在。

（3）线性范围为500U/L，其余评价同酶耦联法评价（2）和（3）。

（四）全血快速定性检测CK-MB质量（CK-MB mass）

1.原理 CK-MB质量（CK-MB mass）可用固相免疫层析法试条快速测定。

2.操作步骤 吸取肝素化或EDTA抗凝的全血150μL加入样本孔，由于膜的作用将血细胞同血浆分离（3min内），定量的血浆随即迁移，标本中的CK-MB同染料标记的CK-MB抗体结合，形成的复合物被固定在测定线上的抗CK-MB抗体捕获而显色。过量的标记抗体继续移动在质控区结合形成沉淀线。阳性检测结果会出现两条沉淀线，阴性结果只有一条质控线。如在规定时间内，没有质控线出现，则视为无效，必须重新测定。

3.评价 此项试验同其他的CK同工酶无交叉反应，胆红素、血红蛋白和三酰甘油不影响结果。

目前已经有ELISA方法定量检测CK-MB的试剂盒，抗干扰和特异性进一步增强，并可较精确定量。

二、乳酸脱氢酶及其同工酶

（一）比色法测定乳酸脱氢酶总活力

1.原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化L-乳酸脱氢，生成丙酮酸。丙酮酸和2，4-二硝苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色。其颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比，由此计算酶活力单位。

2.主要试剂

（1）底物缓冲液（含0.3mol/L乳酸锂，pH 8.8）。

（2）11.3mmol/L的NAD溶液，4℃保存可用2周。

（3）1mmol/L的2，4-二硝基苯肼溶液。

（4）0.5mmol/L丙酮酸标准液。

3.操作步骤

（1）血清0.01mL（另设立对照管）+底物缓冲液0.5mL“37℃水浴5min”测定管加NAD溶液0.1mL，对照管不加→37℃水浴15min→2，4-二硝基苯肼0.5mL，以及NAD溶液0.1mL（对照管不加）→氢氧化钠溶液5.0mL终止反应→室温放置5min后，波长440nm，比色杯光径1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查标准曲线，求得酶活力。

（2）标准曲线：按表3-3制作。

室温放置5min，波长440nm，比色杯光径1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度，并与相应的酶活力单位数绘制标准曲线。

（3）金氏单位定义：以100mL血清，37℃作用15min，产生1μmol丙酮酸为一个单位。

4.参考范围 190～437金氏单位。

5.评价

（1）乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可作为乳酸脱氢酶底物，其中乳酸锂为稳定性较好的固体，容易称量，故常选用。后两种为水溶液，如保存不当易产生酮酸类物质，抑制酶反应，且含量不够准确，所以一般不选用。

（2）除二乙醇胺缓冲液外，也可用Tris或焦磷酸缓冲液。金氏法以前用pH 10的甘氨酸缓冲液，但甘氨酸对LDH有抑制作用，所以现一般改用二乙醇胺缓冲液，这样LDH增高时的检出率加大。

（3）血清含有较多的免疫球蛋白时，IgA、IgG、IgM可与LDH形成复合物，对LDH活性产生抑制作用，使测得活性降低。

（4）因红细胞内LDH浓度为血浆中的360倍左右，因此轻微溶血即可引起LDH浓度增加，为防止LDH从红细胞中逸出，标本必须在采集后2h内离心；离心不彻底的抗凝血，因血浆中富含血小板，同样可引起LDH假性升高。由于LDH-4和LDH-5对冷敏感，所以常规分析的血清应该储存在室温下，室温下血清可稳定至7天。

（二）连续监测法测定LDH总活力

1.原理 LDH催化的反应如下。

当pH在8.8～9.8之间时，正向反应（a）发生，此时在340nm处测得的NADH的吸光度增加，其增加的速率与标本中LDH的总活力成正比关系。IFCC推荐在30℃时测定正向反应，测定正向反应是全自动生化分析的主要方法。

当pH在7.4～7.8之间时，逆向反应（b）发生，在反应过程中，丙酮酸还原成乳酸，同时NADH氧化成NAD⁺，引起340nm处吸光度下降，其下降速率与标本中LDH活性呈正比关系。

2.主要试剂

（1）正向反应（a）的主要试剂：pH值范围：8.9±0.1；Tris-HCl 150mmol/L；L-乳酸锂（MW96.01）50mmol/L；NAD（酵母，MW663.4）6mmol/L。另外以1mL乳酸锂Tris缓冲液（含Tris 52.5mmol/L，乳酸锂52.5mmol/L）加4.2mg NAD⁺配制底物应用液。

（2）逆向反应（b）的主要试剂：pH值范围：7.5±0.1；Tris-HCl 150mmol/L；NAD（酵母，MW663.4）0.2mmol/L；EDTA-Na₂5mmol/L；丙酮酸1.2mmol/L。

3.操作步骤

（1）正向反应（a）的主要操作步骤（以半自动分析仪为例）

①血清稀释度：血清50μL，加37℃预温底物应用液1.0mL，立即吸入自动分析仪，血清稀释倍数为21。

②主要参数：系数：3376；孵育时间：30s；连续监测时间：60s；波长：340nm；吸样量：0.5mL；温度：37℃。

③计算：LDH（U/L）=ΔA/min×3376。

（2）逆向反应（b）的主要操作步骤

①在光径1.0cm比色杯中，加入血清50μL和NADH-Tris-EDTA缓冲液2.0mL，混匀，37℃预温5min（消除血清标本中内源性α-酮酸对NADH的消耗）。再加入0.2mL已预温的丙酮酸溶液，混匀，记录340nm波长处吸光度的下降速率（-ΔA/min）。

②计算：LDH（U/L）=ΔA/min×7234。

4.参考范围 ①LDH-L法：109～245U/L；②LDH-P法：200～380U/L。

5.评价

（1）正向反应以L-乳酸锂和NAD为底物，为乳酸→丙酮酸的反应（简称LDH-L法）；逆向反应以丙酮酸和NADH为底物，为丙酮酸→乳酸的反应（简称LDH-P法）。作为IFCC的推荐方法，LDH-L法的主要优点有：乳酸盐和NAD底物液的稳定性比丙酮酸盐和NADH底物液的稳定性好，前者冰冻保存可稳定6个月以上，后者只能保存数天；LDH-L法的线性范围也较宽，重复性比LDH-P法好。

（2）由于逆向反应速度比正向反应速度快，且测定方法不同，参考范围也有所不同，LDH-P法的参考值约为LDH-L法的2倍。

（3）LDH-P法中，如有微量金属离子存在，NADH的稳定性较差，此时可于试剂中加入EDTA以螯合金属离子，增加NADH的稳定性。

（4）关于内源性α-酮酸对NADH的消耗问题（LDH-P法），有学者认为需要3～5min预孵育期，但也有学者认为内源性反应不会显著改变，ΔA/min的值，各实验室最好通过预试验确定。

（5）其余同比色法评价（4）。

（三）选择性测定LDH同工酶LDH₁

1.原理 LDH是由H亚基和M亚基组成的四聚体，共有五种LDH同工酶（LDH isoenzyme）。LDH₁的组成为H₄，通过选择性抑制M亚基，即可检测LDH₁。

（1）化学抑制法：将1，6-己二醇或高氯酸钠加到含样本的反应液中，选择性地抑制含M亚基的LDH同工酶，由于LDH₁由4个H亚基组成，因此只有LDH不被抑制，可被测定。

（2）免疫抑制法：将抗M亚基的抗体加入，与含M亚基的同工酶形成免疫复合物，离心移去免疫复合物，上清液中只有唯一不含M亚基的LDH₁被测定。

2.主要试剂 除化学抑制剂或免疫抑制剂外，其余试剂同比色法或连续监测法。

3.操作步骤 除先行抑制外，其余步骤同所选方法（比色法或连续监测法）。

4.参考范围 ①化学抑制法：15～65U/L；②免疫抑制法：18～34U/L。

5.评价 免疫抑制法的特异性较化学抑制法好，且经离心去除沉淀后再行下一步测定，对后续测定影响较小，所以该法较理想，但抗体较贵。其余评价同比色法或连续监测法。

（四）琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶

1.原理 LDH由M和H亚基组成，H亚基含较多的酸性氨基酸，在碱性缓冲液中带有较多的负电荷，因此含H亚基多的LDH同工酶在电泳时迁移快，加之各同工酶分子形状不同，它们在琼脂糖凝胶中电泳后可分离成五条区带，从阳极到阴极分别为LDH₁、LDH₂、LDH₃、LDH₄、LDH₅。经酶染色后用光密度计扫描，即可计算出各同工酶百分比。

2.主要试剂

（1）基质-显色液：①乳酸溶液：85%乳酸2.0mL用氢氧化钠调pH值至7.0；②lg/L的吩嗪甲酯硫酸盐溶液；③1g/L NBT溶液；④10g/L NAD⁺溶液。临用前分别顺次吸取四种溶液4.5mL、1.2mL、12mL、4.5mL，混匀即为基质-显色液。

（2）其余试剂：如电泳缓冲液、固定漂洗液等，均按电泳常规试剂配制。

3.操作步骤 常规制作5g/L琼脂糖凝胶板，根据LDH总活性大小加样20～40μL。电泳条件为：①电压：75～100V；②电流：8～10mA/板；③电泳时间：30～40min。

将基质-显色液与经沸水融化的8g/L琼脂糖凝胶液，按4∶5的比例混合制成显色凝胶，避光置于50℃水浴中备用。电泳结束后，取下凝胶板置于铝盒中，立即用滴管吸取显色凝胶液约1.2mL滴于电泳板上，使其自然铺开，完全覆盖。待显色凝胶液凝固后，置铝盒于37℃水浴中保温1h。显色完毕后，常规固定和漂洗凝胶，置光密度计中于570nm波长处扫描，即可求出各区带的百分比。

4.参考范围 ①LDH₁：（28.4±5.3）%；②LDH₂：（41.0±5.0）%；③LDH₃：（19.0±4.0）%；④LDH₄：（6.6±3.5）%；⑤LDH₅：（4.6±3.0）%。

5.评价

（1）基质-显色液中的递氢体对光敏感，所以显色液需避光保存和使用，否则显色后凝胶板的背景色深；NBT被大量用来证实同工酶的活力，但非脱氢酶也可导致非特异染色，在相当于LDH₁和LDH₃的位置出现干扰。

（2）LDH同工酶电泳时可观察到电泳谱带变宽的现象，如电泳谱带宽度为LDH₁>LDH₂>LDH₃>LDH₄>LDH₅，则为H亚基的H'变异；如LDH₁<LDH₂<LDH₃<LDH₄<LDH₅，则为M亚基的M'变异。LDH同工酶变异往往可造成对测定结果的错误解释。

（3）其余评价与普通琼脂糖电泳相同。

三、糖原磷酸化酶及其同工酶BB

（一）比色法测定糖原磷酸化酶

1.原理 根据糖原分解第一步的逆反应，糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）催化如下反应。

通过测定反应液中磷酸的含量来确定酶活性。

2.主要试剂

（1）混合缓冲液（pH 8.6）：40mmol/L甘氨酰甘氨酸，30mmol/L巯基乙醇，8mmol/L EDTA。

（2）3.3%糖原溶液，83mmol/L的葡萄糖-1-磷酸，5mmol/L AMP。

（3）2%十二烷基磺酸钠，35mmol/L硫酸溶液，氨基萘磺酚酸。

3.操作步骤

（1）于试管中依次加入下列溶液：待测血清250μL，混合缓冲液250μL，3.3%糖原溶液300μL，83mmol/L葡萄糖-1-磷酸溶液200μL，5mmol/L AMP液200μL。

（2）37℃水浴4min、64min、124min后，分别取反应混合液200μL，加入2%十二烷基磺酸钠1.2mL，35mmol/L硫酸溶液1.2mL，以及氨基萘磺酚酸后混匀，室温下显色30min，在700～730nm波长处读取吸光度值。

（3）单位定义：以每毫升血清每分钟生成的磷酸mmol数表示其活性（即mU）。

4.参考范围 各实验室自己建立。

5.评价 本法以反应生成的磷酸为目标物来指示糖原磷酸化酶的活性，因此在试剂配制和分析中，应注意含磷酸基团物质的干扰。

（二）ELISA法测定糖原磷酸化酶同工酶BB

1.原理 应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人糖原磷酸化酶同工酶BB（glycogen phosphorylase-BB，GP-BB）水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入人GP-BB、生物素化的抗人GP-BB抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GP-BB呈正相关。

2.主要试剂 由试剂盒提供，主要包括酶联板、样品稀释液、检测稀释液、底物溶液、浓洗涤液、终止液等。

3.操作步骤 各试剂在使用前需平衡至室温。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，严格按试剂盒说明书操作。用酶标仪在450nm波长处测量各孔的吸光度值。

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），吸光度值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的吸光度值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与吸光度值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光度值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数即可。

4.参考范围 为1.6～19μg/L。

5.评价

（1）如标本中待测物质含量过高，应先稀释后再测定，最后乘以稀释倍数。

（2）洗涤过程应充分，否则易造成假阳性。