第三节 乳酸菌的使用
几十年来，人们对MLF进行了大量的研究，但目前仍存在着一些需要解决的问题，发酵工程技术在MLF中的应用还只是处在一个开发和研究的阶段，MLF还只能部分地进行。虽然通过基因工程技术选育出了苹果酸乳酸菌，但菌株的遗传稳定性、苹果酸-乳酸酶基因和苹果酸通透酶基因在工业果酒酵母菌中的表达及其安全性等问题还有待解决。目前，选育耐低pH、较高酒精度和SO2，且酿酒特性好的乳酸菌种的需求较为迫切，MLB的营养条件、MLF的发生与控制的研究还需加强。
一、自然苹果酸-乳酸发酵的风险
自然进行的苹果酸-乳酸发酵，无法控制、诱导或选择参与发酵的乳酸菌，从而无法获得可预测的结果，酒的质量将面临极大的风险；接种人工筛选和优化的酒类酒球菌以及严格控制整个发酵过程是获得良好的MLF结果的根本保证。
众所周知，乳酸菌将果酒中的乳酸转换成苹果酸的同时，亦将产生一系列副产物。其中有些副产物是有益的，如乙酸乙酯和丁二酮等，它们使果酒香气更加复杂，酿酒师通常会通过对苹-乳发酵有效的控制适当获得这类有益的副产物。但如果对苹-乳发酵不加以控制或对发酵进程失控，不可避免地就会有一些无益的或有害的副产物产生，这是酿酒师所不愿意看到的。为了保证获得尽可能完美的结果，应当尽量避免发生自然的、无控制的MLF。失控的、自然进行的乳酸菌的新陈代谢可能带来的风险或缺点如下。
1．刺激的酸乳味
当酒精发酵后期发酵速度过于缓慢，或发酵意外停止时，果酒中会存在一定的残糖，细菌首先会利用这些糖，将糖转化成乙醇、醋酸和CO2，同时将一定量的酒石酸转化成D-乳酸，给酒带来较浓烈的酸乳味。
2．苦味
由于酒中甘油分解成丙烯醛，而丙烯醛与酒中的单宁结合，给予酒一种令人非常不愉快的“苦味”。
3．挥发性酚的产生
4-乙烯基酚、4-乙烯基愈创木酚和4-乙基酚等挥发性酚类会给酒带来类似马厩或马汗的气味。通常，挥发性酚是由足球菌属和乳杆菌属的细菌产生的。
4．某些化合物
有些乳酸菌在新陈代谢时，会将酒中的精氨酸转化，形成瓜氨酸，而瓜氨酸是氨基甲酸乙酯的前体，氨基甲酸乙酯对人的健康是有害的。在欧洲，许多国家对此物质进行严格的检测和限制。此外，某些特殊的氨基酸会产生脱羧反应，导致生成各类生物胺(如组胺、腐胺、尸胺等)，它们对人的健康均有害。
不良气味和口感的产生，取决于在MLF过程中，何种乳酸菌起主导作用。当然，某些菌属的乳酸菌，对苹果酸-乳酸发酵的顺利进行、果酒质量的改善、果酒微生物稳定等方面是有积极意义的。它们转化了酒中的苹果酸，同时产生了一些对酒有益的副产物，降低了酒的总酸，使酒的成分更均衡，并对酒的色素尽最大的保护。就目前研究和实践所取得的成果而言，人工选择并优化后接入酒中的酒类酒球菌正是其中最出色的一种。因此，人工接种优选乳酸菌进行MLF，是避免上述诸多不良副产物的出现，并有效控制和正确引导MLF的不二方法。人工优选的乳酸菌，会产生适量的乙酸乙酯、丁二酮等副产物，增加酒的香气和复杂性。与此同时，增加了可感知的浆果品种香，减少了酒的生青味、粗糙的“涩感”和“苦味”。考虑到某些种属的乳酸菌在繁殖时，会消耗一定的乙醛，导致SO2的浓度有所降低，因此，在MLF之后，通常建议分析SO2并决定是否适当补充SO2。某些种属的乳酸菌，特指酒类酒球菌属，会生成对提高酒质量有益的有机物，增加酒的“醇厚感”和后味，这是为什么人工筛选的乳酸菌均为酒类酒球菌属的重要原因。
二、苹果酸-乳酸发酵的诱导
1．自然诱导
提供适宜的环境条件，MLF可以自然发生。但是，自发的苹果酸-乳酸发酵是难以预测的，由于酒精发酵后的有些果酒中可能还存在乳酸菌的噬菌体，它们可能延迟或抑制MLF，使得MLF在触发上难以保证。这种延迟对果酒酿造者而言，是相当昂贵的，它增加了腐败菌在进行繁殖的同时产生异香与异味，导致酒病害的可能性。温暖的气温、很低的SO2、适宜的pH值，非常有利于微生物腐败。
2．人工接种诱导
生产上常利用优良乳酸菌种经人工培养后添加到果酒中，以克服自然发酵不稳定、难控制等问题。现在人们已开始应用更为简单的方法进行MLF，如可利用引子培养物(含乳酸菌的发酵剂)，不但可以迅速达到触发MLF的数量级，而且在MLF过程中居于主导地位，有利于酿造优质果酒。目前，一些冷冻干菌种不用活化和扩培就可以直接加入到果酒中。根据不同的地域条件和原料品质选择适宜的菌种进行MLF，成为酒厂酿制优质高档佳酿的关键。
三、现代发酵工程技术在苹果酸-乳酸发酵中的应用
由于MLF对发酵条件的要求比较复杂，生产上常常出现MLF发酵迟滞甚至接种失败的现象。为此，酿酒者希望有快速、可行的方法启动并完成MLF，近年来，现代发酵工程技术的进展，为革新MLF的工艺操作提供了新的思路。
1．固定化技术
固定化技术是20世纪60年代在相应学科发展的基础上产生的一种新的生物技术。所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的微生物细胞或酶，定位于限定的空间区域并使其保持活性，使之成为连续流动的生物反应器，并可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
微生物的固定化法主要有包埋法、吸附法、交联法和微胶囊化4种方法。以前用于MLF的固定化技术只有包埋法和吸附法两种。固定化的乳酸菌降解了30%的苹果酸，使白葡萄酒的pH从3.15上升到了3.40，对苹果酸的转化率是游离乳酸菌细胞的2倍，且稳定性好，可持续达6个月。
与固定化细胞技术相比，固定化酶技术需要酶的分离，并且需要辅酶再生，因此该技术在生产上的应用受到很多限制。用商业的Saccharomyces cerevisiae菌株(Uvaferme 299)制成固定化生物催化剂，用于常温(15～25℃)的干白葡萄酒的发酵，发酵产物具有低挥发酸、低甲醇和低乙醛含量等特性，该固定化细胞系统可稳定持续4个月，感官评价表明与游离细胞系统相比，葡萄酒风味品质有明显改善。
2．膜生物反应器(membrane bioreactor，MBR)的应用
膜生物反应器技术是对固定化技术的发展，是通过凝胶膜、人工聚合膜或其他膜载体把酶/酶、酶/辅酶、酶/细胞或细胞器/酶等反应组元固定起来(也可以是游离态)进行生化反应。有人从酒明串珠菌8406中提取纯化了MLE，并把游离的MLE和辅酶因子通过特制的polysulfone膜及有机玻璃反应板制成生物反应器进行MLF，结果表明，苹果酸的分解率可达70%以上。
3．分子生物学
近年来，分子遗传学手段已经应用到了葡萄酒微生物的育种领域。科学家等曾进行过不同乳酸菌Mle基因在酿酒酵母中的功能表达。有人克隆了酒类酒球菌(Oenococcus oeni)的MleA基因，在大肠杆菌中得到表达，其蛋白的分子量为60kD。Ansanay等使多拷贝的MleS基因在乙醇脱氢酶Ⅰ(ADHⅠ)启动子控制下，在Saccharomyces cerevisiae中得到较高水平表达，其MLE活性是Lactococcus lactis的3倍，他们的研究使得Mle在酵母菌中的表达较前有较大幅度的提高，但含有Mle基因的酵母转化子降解外源L-苹果酸的效率仍局限在20%以下。酿酒酵母体内由于缺乏L-苹果酸的转运蛋白而引起苹果酸盐的转运效率受到限制，是酵母转化子降解外源L-苹果酸效率不高的主要原因，将Lactococcus lactis的Mle基因和Saccharomyces pombe的苹果酸通透酶基因(Mae1)在酵母中共表达，使L-苹果酸的降解能力大幅度提高。将苹果酸通透酶基因和MleS基因同时克隆到酿酒酵母中，这样就解决了底物苹果酸转移到细胞内的问题。
构建可进行MLF的酵母工程菌，可免去依赖乳酸菌的MLF过程，使两步发酵由酵母菌单独完成，缩短酿造周期，避免细菌在MLF过程中产生不必要的代谢副产物，并可减少细菌引发果酒破败的危害。这不仅可深化对果酒微生物降酸机制的了解，而且可以丰富和发展果酒酿造的工业微生物学理论，简化果酒的酿造工艺，经济有效地控制生物降酸过程。因此，对MLF相关酶及基因的深入研究，具有重要的理论意义和实际应用价值。但同样也面临着许多的问题，如苹果酸-乳酸酶基因和苹果酸通透酶基因在工业微生物酵母菌中的表达及其安全性，以及菌株的遗传稳定性等问题还有待解决。
四、乳酸菌的接种量和接种时间
人工诱导苹-乳发酵能够更好地控制酒的香气和口感，酒类酒球菌是最有效且最常用的商品乳酸菌。优良酒类酒球菌能够有效降低其他类型乳酸菌的不良发酵对酒产生的负面影响。
诱发苹-乳发酵乳酸菌的最低接种量为106CFU/mL，若接种量不足会严重影响苹-乳发酵的启动，延缓发酵进程。采用较高乳酸菌接种剂量能够快速启动苹-乳发酵，加快发酵速率，但也会降低双乙酰的生成量。
但是，潘海燕等认为过高的接种量可能会使苹果酒在MLF后因乙酸含量过高而具有不好的口感。通过实验，发现乳酸菌的接种量越高，发酵结束以后乙酸的浓度也就越高，在接种量从6%变化到10%的过程中，乙酸的浓度增加了近一倍，所以为了提高苹果酒的品质要严格控制接种量。在乳酸发酵顺利进行的情况下，采用较小的接种量有利于提高苹果酒的风味。
乳酸菌的接种时间一般有如下3种选择：与酵母同时接种；在酒精发酵期间接种；在酒精发酵完成后接种。
不同时期接种各有特点，在酒精发酵后接种，由于酵母菌体自溶产生了较多的适合乳酸菌生长的营养物，由乳酸菌引起的糖代谢，继而产生大量的醋酸和D-乳酸的危险性可降至最低限度，同时也避免了潜在的酵母生长的拮抗作用。另外，酿酒期趋于结束，对人力物力的需求高峰已过，此时接种乳酸菌较为方便。与酵母同时接种或在酒精发酵期间接种可以使乳酸菌利用较多的营养物质，由于此时酒精浓度较低，为细胞生长提供了更好的机会，接种后，由于乳酸菌适应了不断增加的酒精浓度，使细胞死亡率降至最低，它可以使苹果酸-乳酸发酵在酒精发酵结束之前或刚刚结束时迅速完成，这样可以有效地缩短发酵周期，减少酒的处理过程，尤其是用橡木桶发酵的葡萄酒。如果SO2的添加量很小，乳酸菌可以在果实破碎时添加或与酵母同时添加。对于含SO2的果酒，建议在酒精发酵之后或发酵期间接入乳酸菌，以使游离SO2化合。因此，接种时间的选择应根据酒的种类、果汁的组成、酵母菌株、作业条件等灵活掌握。
五、苹果酸-乳酸发酵过程的检查与控制
1．接种前检查
pH，3.2～3.5；温度，18～20℃；SO2浓度，无游离SO2或微量，总SO220～40mg/L；酒精浓度，<14%(体积分数)；营养状况，与皮渣接触时间、浆果品种有关；自然菌群，有用的和有害的；MLF的潜力，难易程度。
2．每隔2～4天检查
检查并保持温度18～20℃；分析L-苹果酸含量(每天下降0.1～0.2g/L为最好)；显微镜检查，包括细胞数量的增加及菌链的形状；感官鉴定。
3. MLF结束
L-苹果酸含量<0.1g/L；自然发酵4～12周；人工发酵2～8周。
4．无活性的MLF
检查搅拌罐；重新检查所有的酒参数；确定活菌的数量(选择性培养基/荧光显微技术)，检查其他微生物的活性、细菌与酵母的拮抗作用；农药残存量；用不同菌种的新鲜培养液重新接种。
六、苹果酸-乳酸发酵的检测
苹果酸-乳酸发酵的特点是滴定酸和pH的变化，但是以上变化的程度不一样，并且可能被酒中其他反应所掩盖，这是因为其他反应会引起酸度和pH变化。但是乳酸含量的变化也不能说明苹果酸-乳酸发酵的进行，因为酵母和细菌利用其他碳源也可能产生乳酸。能判断苹果酸-乳酸发酵是否进行的最好方法是检测果酒中苹果酸的变化。
检测苹果酸含量的需用方法有纸色谱法、酶分析法和液相色谱分析法。液相色谱分析法所需的设备十分昂贵，一般仅在大型的理化分析检测中心和果酒厂才有，而纸色谱法和酶分析法在大多数果酒厂均能实现。
1．纸色谱法
纸色谱法是一种以滤纸为支持物的色谱分析方法，主要利用分配原理。滤纸吸附的吸附水是固定相，展开剂为流动相，滤纸只起到支持固定相的作用，流动相促进组分向前移动，固定相阻碍了它的前进，所以各组分以小于溶剂移动的速度向前移动，使不同的组分分开。各组分具有不同的分配系数K，K大的组分移动速度慢，K小的组分移动速度快。
定性依据：比移值Rf表示样品组分在滤纸上的位置，也表示组分在流动相和固定相中运动的情况。
纸色谱法原理：将果酒以小圆点的形式点样于滤纸上，经展开、显色后，根据比移值与标准比较定性、定量。酒石酸移动速度最慢，离点样点最近，酒石酸Rf在0.26～0.30；乳酸和琥珀酸速度最快，被推动到滤纸的最顶端；乳酸和琥珀酸Rf在0.69～0.76；苹果酸移动的速度处于两者之间，苹果酸Rf在0.52～0.56之间。
操作方法：滤纸为长方形(20cm×30cm)，沿长的一边距下边缘2.5cm处点果酒样，两点之间间隔为2.5cm。每一个点用微量吸管点4次样，两次点样之间要风干，点样总体积约10μL(点越小分辨率越高)。然后用3个订书钉沿短边卷起形成一圆柱筒，注意不要接触纸边或使边缘重叠，用带螺旋盖的约4L的大口缸做色谱缸。在分液漏斗中装10mL水、100mL正丁醇、10.7mL浓甲酸和15mL含量为10g/L的溴甲酚绿溶液，在通风橱或通风良好的防火区域摇匀混合，几分钟后将下相放出弃之不用，将上相70mL放入色谱缸内，将滤纸的点样边浸入溶剂，盖好盖，展开时间为6h左右，即可得到最佳结果，展开时间延长至过夜也是安全的，即使溶剂达到上边缘。或者约3h后取出滤纸，这时圆柱纸筒只用了10cm，取出黄色滤纸后，将其放在通风良好的地方风干，直至甲酸完全挥发，剩下为蓝绿色背景上带黄色的各种酸的斑点。每次纸色谱分离后，将溶剂中水相除去可重复使用。当需要在3h内得到结果时应采用酶分析法。
2．酶分析法
应用酶法检测苹果酸-乳酸发酵过程中L-苹果酸的含量，可有效实现苹果酸-乳酸发酵过程的工艺控制。该方法特异性好，灵敏度高，简便快速，定量准确，能够满足实际检测的需要。经实际验证测定一个样品仅需20min左右，能广泛地应用于苹果酸-乳酸发酵过程中苹果酸的分析测定，对于酿酒企业监控和掌握苹果酸-乳酸发酵进程具有重要的指导作用。
(1)原理 苹果酸存在于果汁和果酒当中，可以在苹果酸脱氢酶(MDH)的催化作用下，被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化生成草酰乙酸。在这个过程中生成的NADH，可通过紫外分光光度仪在波长340nm条件下测定其吸光度，以计算其含量，并最终得出样品中L-苹果酸的浓度。但是这个转化过程可逆，因此有必要消耗掉生成的草酰乙酸，使反应进行彻底。而草酰乙酸可以与L-谷氨酸在谷草转氨酶(GOT)催化下反应，在此过程中，草酰乙酸被不可逆地转化成L-天冬氨酸，因而L-苹果酸可以与最终生成的NADH形成稳定的对应关系，即可以通过测定生成的NADH含量来推算样品中L-苹果酸的含量。
(2)测定方法 在20～25℃条件下，选取1cm石英比色皿，按顺序依次加入1000μL缓冲液、200μL NAD工作液、1000μL蒸馏水、10μL GOT工作液、100μL试样(对照是加100μL蒸馏水)。将加好试剂的比色皿轻轻混匀，静置3min后读取吸光度值A1，再加入10μL MDH工作液，混匀后静置10min，读取吸光度值A2。
(3)结果计算 计算空白、标准品和待测样品的净吸光度AN，AN＝A2－A1；通过净吸光度和实测吸光度，计算各样品的吸光度修正值Ac，Ac＝样品AN－空白AN。L-苹果酸浓度计算公式：
CL-苹果酸(g/L)＝0.4725Ac×稀释倍数
运用本方法测定苹果酸时，为保证结果的准确性，一般需要进行如下处理：样品测定前进行适当的稀释，以确保此时的苹果酸浓度小于0.4g/L。对于未经稀释的红酒或颜色比较重的果酒，需要进行脱色处理。方法如下：取5mL样品，加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，混匀震荡约1min，然后用0.45μm滤膜过滤。
在苹果酸-乳酸发酵结束时，立即分离转罐，同时进行SO2(50～80mg/L)处理。
如果已经有正在进行苹果酸-乳酸发酵的果酒，可用“串罐”的方式使需要的酒进行该发酵。如果要在发酵前加入乳酸菌，应选用植物乳杆菌的菌系；而在酒精发酵结束后添加乳酸菌，则应选用酒类酒球菌的菌系。在使用商品活性干乳酸菌时，应按说明书的要求操作。对于不需要进行苹果酸-乳酸发酵的果酒，应采取相应措施，防止微生物的活动。