第一节 乳酸菌及代谢
一、乳酸菌的种类
与果酒苹果酸-乳酸发酵相关的乳酸菌分布于两科四属：乳杆菌科的乳杆菌属，该细菌细胞呈杆状，革兰阳性。链球菌科的酒球菌属、片球菌属和明串珠菌属，这三个属的乳酸菌细胞呈球形或球杆形，革兰阳性。在众多乳酸菌中，酒类酒球菌是最重要的乳酸菌，而且是唯一在低pH(pH<3.5)下诱导MLF的乳酸菌。有害的乳酸菌一般是乳杆菌与片球菌。
按照乳酸菌对糖代谢途径和产物种类的差异，可以把它们分为同型乳酸发酵细菌和异型乳酸发酵细菌，分别进行同型和异型乳酸发酵。异型乳酸发酵是指葡萄糖经发酵后产生乳酸、乙醇(或乙酸)和CO2等多种产物的发酵；同型乳酸发酵是指产物中只生成乳酸的发酵。
乳酸菌中，用于苹果酸-乳酸发酵商业发酵剂的细菌只有酒类酒球菌和植物乳杆菌，其中酒类酒球菌发酵剂最为常用。片球菌也能进行苹果酸-乳酸发酵，但该属细菌发酵时，容易引起葡萄酒的变质，因此通常认为是一类有害乳酸菌。当果酒的pH低于3.5时，其他种类的乳酸菌生长受到抑制，酒类酒球菌处于主导地位；而当pH高于3.5时，乳杆菌和片球菌便会快速繁殖，并能引起果酒的乳酸菌病害。
1．乳杆菌属
该属为革兰阳性、微好氧、在显微镜下呈长杆、短杆或球杆状的细菌，通常过氧化氢酶阴性，经己糖代谢途径进行同型或异型乳酸发酵。乳杆菌对酸的忍耐性很强，适宜于在酸性条件(pH 5.5～6.2)下启动生长，通常5% CO2促进生长。在营养琼脂上的菌落凸起、全缘和无色，直径2～5mm。化能异养菌，需要营养丰富的培养基；发酵分解糖代谢，终产物中50%以上是乳酸。最适生长温度30～40℃。广泛分布于环境，特别是动物、蔬菜和食品中。在世界各地葡萄和葡萄酒中分离出的乳杆菌包括同型发酵类型，如干酪乳杆菌、植物乳杆菌、米酒乳杆菌、同型腐酒乳杆菌以及异型发酵类型，如短乳杆菌、希氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、布氏乳杆菌和发酵乳杆菌等。
2．明串珠菌属
明串珠菌属革兰阳性，细胞为球形或双凸透镜形，通常成对或成短链。有些菌株形成荚膜。生长要求包括适当的糖类和一系列维生素，如生物素、硫胺素、烟酸和叶酸。葡萄糖通过异型乳酸发酵而代谢，形成乳酸和乙醇或醋酸。最适生长温度约25℃。大多数细菌不能在葡萄酒pH条件下生长，只有肠膜明串珠菌偶然出现。
3．酒球菌属
酒球菌属以前被划入明串珠菌属，酒类酒球菌革兰阳性，不运动，兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，椭圆体或球形，通常成对或链状出现。在显微镜下很难与呈短杆状的杆菌区分，嗜酸。生长于pH 3.5～3.8葡萄汁和果酒中，在起始pH4.8的条件下生长更好。10%(体积分数)乙醇不抑制其生长。最适生长温度22℃。在15℃生长缓慢。有可发酵的碳水化合物时，可将苹果酸盐转变成L-(＋)-乳酸盐和CO2。代谢不活跃，仅发酵少数几种碳水化合物。喜好果糖，通常发酵海藻糖。在葡萄汁或果酒中发酵戊糖(阿拉伯糖或木糖)，因此导致二次生长现象。异型发酵，基本上将葡萄糖发酵成等摩尔的D-乳酸、CO2和乙醇或醋酸盐。目前只包括一个种，即酒类酒球菌，它是目前启动果酒苹果酸-乳酸发酵最重要、应用最广泛的乳酸菌。酒类酒球菌为异型乳酸发酵菌，绝大多数菌株利用L-阿拉伯糖、果糖、核糖，但不能利用半乳糖、乳糖、麦芽糖、松三糖、棉子糖、木糖。酒类酒球菌能够利用葡萄酒中的苹果酸生成乳酸。
需要说明的是，酒球菌过去定名为酒明串珠菌。在报道的明串珠菌属的种中，酒明串珠菌是唯一嗜酸的一个种，来源于酒和有关的环境。这个种的菌株与其他明串菌属的种，在许多方面的特性不一致。它们可生长于初始pH4.8和含体积分数10%的乙醇培养基中，绝大多数菌株需要一种番茄汁生长因子。它们缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，D-乳酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的电泳迁移率都明显不同于其他种。酒明串珠菌的全细胞可溶性蛋白图谱与其他种也不一样。在基因型遗传方面的研究结果，也进一步证明酒明串珠菌与其他种不同，这个种与其他种的DNA-DNA同源性都低。DNA-RNA杂交和rRNA序列分析也显示了酒明串珠菌的特别之处，尤其是16SrRNA序列分析和23SrRNA序列研究显示，这个种与明串珠菌属其他种在亲缘上不相关，完全属于另一分支，鉴于以上表现型和遗传型与明串珠菌属其他种的明显差异，有人提出应将这个种列为一个新属，称为酒球菌属；将酒明串珠菌重新分类，定名为酒球菌。这一提法，得到学术界的普遍认同。
4．片球菌属
片球菌细胞球形，直径1.2～2.0μm。在适宜条件下，在直角两个平面交替分裂形成四联状，一般细胞成对生，单个细胞罕见，不形成链状，不产芽孢，革兰阳性，不运动。兼性厌氧，有的菌株在有氧时会抑制生长。触酶阴性，氧化酶也阴性。最适生长温度25～40℃。该属菌同型乳酸发酵，发酵糖类(主要是单糖和双糖类)，葡萄糖产酸不产气，将葡萄糖转化成L-或DL-乳酸。葡萄糖受限时，戊糖片球菌降解甘油生成丙酮酸，后者经“活性醛途径”进一步分解成乙酸、双乙酰或2，3-丁二醇。片球菌是化能有机营养生物，需要复杂的生长因子和氨基酸。
在葡萄酒中总共分离出3种片球菌：有害片球菌、小片球菌和戊糖片球菌。有害片球菌和小片球菌更为常见。
二、影响酒类酒球菌生长的因素
酒类酒球菌是使苹果酸-乳酸发酵能够顺利进行的最重要的启动者，也是在果酒的严峻生境中耐受性最强的菌种，果酒中乙醇浓度、SO2含量、pH值、温度都是制约酒类酒球菌生长的重要因素。
1．乙醇的影响
酒类酒球菌是革兰阳性细菌，没有完整的细胞结构，直接由细胞膜包被，所以细胞膜是其抵御不利环境的第一道屏障，在受到胁迫反应时，为避免影响细胞新陈代谢的正常进行，细胞膜物理特性和流动性需要不断调整，以维持其屏障作用和酶活性。乙醇胁迫主要影响酒类酒球菌细胞膜的结构和功能，研究显示，随着乙醇浓度的升高，细胞膜的流动性和通透性增加，质子或其他离子的透过率增加，致使能量转化效率降低。随着乙醇处理时间的延长，细胞存活率显著降低，不同乙醇浓度对细胞的影响出现明显差异。处理时间30min时，14%乙醇处理会使菌体细胞发生不可逆的硬化，而10%和12%乙醇处理发生的硬化是可逆的，当胁迫条件移除时细胞膜会恢复至初始状态。
处理时间相同时，细胞存活率随着乙醇浓度的增加而降低，即乙醇浓度越高对细胞活力的影响越大。也有研究指出，当环境中存在10%乙醇或更少量乙醇(3%～5%或7%)时，可促进菌体的生长，当酒精浓度高于12%时，将显著抑制酒类酒球菌的生长。
2．温度的影响
酒类酒球菌的细胞经低温处理后，细胞膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比率上升，而膜中环丙烷脂肪酸的含量增加，同时，细胞膜的流动性大大降低。研究发现细胞在经低温处理后，细胞膜会发生明显的硬化现象，且温度越低其硬化现象越明显，然而其细胞活力未受到明显影响。细胞经短时间低温处理后，将温度回升至原来温度时，其细胞膜的流动性也会恢复至原来状态，且细胞膜及蛋白质组分并未发生明显变化。即低温胁迫会影响细胞膜中脂肪酸及蛋白质组分，却不影响细胞的存活率，且此过程是可逆的。低温不仅会影响细胞膜的流动性，更会使得细胞内的酶活性暂时降低，抑制了细胞内各种生化反应的进行，当温度回升，这种抑制作用便会解除。
高温会增加细胞膜的流动性及通透性，甚至导致细胞内代谢物流出，温度过高时会影响细胞膜中的酶活性，进而影响细胞的存活率。在42℃条件下培养细胞时，菌体的生长明显受到抑制，且高温胁迫诱导了胁迫蛋白的合成。这种机制使得酒类酒球菌细胞能够存活并繁殖。并且酒类酒球菌细胞经42℃处理后直投入果酒中发酵可明显提高细胞在果酒中的存活率以及诱发苹果酸-乳酸发酵顺利进行的能力。酒类酒球菌细胞受到高温胁迫时，细胞内的热休克蛋白含量增加。
3．酸的影响
酒类酒球菌生长的最适pH值为4.8～5.5，而果酒的pH值通常偏低，即对酒类酒球菌而言是一个低pH值的胁迫环境，pH值的高低决定苹果酸-乳酸发酵是否能够顺利进行。当pH值较低时，酒类酒球菌细胞膜中乳杆菌酸的含量显著增加。乳杆菌酸有利于维持细胞膜的完整性及稳定性。酒类酒球菌在酸胁迫条件下时，能诱导膜上H＋-ATP酶的活性增强。该酶不仅在苹果酸-乳酸发酵过程中发挥作用，而且在抗酸机制中也发挥重要作用。H＋-ATP酶可耦合ATP水解，将质子排除细胞外，从而调节细胞内外的pH值，以维持细胞膜特性，保证细胞的正常生长。
三、乳酸菌糖代谢及风味物质的形成
大多数果酒经酒精发酵结束后都含有残糖，浓度很低，比如己糖(葡萄糖和果糖)以及戊糖(核糖、阿拉伯糖和木糖)，这些糖均能被乳酸菌所代谢。乳酸菌能利用己糖以及戊糖，经过分解代谢产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，有些可直接作为风味物质或是重要风味物质的前体。在发酵过程中，乳酸菌同型发酵代谢糖类主要产生乳酸，异型发酵代谢产生乳酸、乙醇及二氧化碳等发酵产物，也产生乙醛、丙酮、乙偶姻、双乙酰等多种挥发性芳香化合物，促进良好风味的形成。葡萄糖经过己糖的磷酸化、磷酸己糖的裂解、氧化脱氢等糖酵解步骤生成ATP及中间代谢产物丙酮酸，丙酮酸往往是后续反应的起点，最终释放出不同的香味和味觉活性化合物。主要有以下6种途径。
① 丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下直接还原成乳酸。
② 丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在双乙酰合酶的作用下生成双乙酰。
③ 在α-乙酰乳酸合成酶(ALS)的作用下生成α-乙酰乳酸，可经氧化脱羧生成重要的食品风味物质双乙酰；此外α-乙酰乳酸还可以在α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)催化下生成另一重要的风味化合物乙偶姻。
④ 丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)的催化作用下转化成乙酰CoA，继而在乙醛脱氢酶(ALDH)的作用下生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下生成乙醇。
⑤ 葡萄糖先经过磷酸戊糖途径(HMP)生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛并释放二氧化碳，乙酰磷酸在乙酸激酶(AK)作用下产生终产物乙酸，3-磷酸甘油醛的终产物为乳酸。
⑥ 丙酮酸脱羧形成的乙酰CoA，另外一条去路是与草酰乙酸在柠檬酸合酶催化下生成柠檬酸，进入三羧酸循环(TCA)，进而生成琥珀酸、苹果酸等有机酸。此外，草酰乙酸在草酰乙酸脱羧酶(OAD)的作用下经过脱羧反应生成丙酮酸，丙酮酸可进一步转化成乳酸。
苹果酸-乳酸菌可以分解代谢柠檬酸生成乳酸以及双乙酰、乙偶姻等风味物质，对果酒的感官品质具有重要影响。在低pH值条件下，当基质中无可发酵糖时，苹果酸-乳酸菌几乎不分解柠檬酸，而当有可发酵糖存在时，乳酸菌对柠檬酸和葡萄糖的分解代谢速度都提高，乳酸菌生长比率与生长量均明显增大。因此，乳酸菌对柠檬酸-葡萄糖进行着共代谢。共代谢首先在乳品发酵过程中得到研究和证实，并已证明这种现象也存在于苹果酸-乳酸发酵过程中。在柠檬酸-葡萄糖共代谢途径中，两者的影响是相互的。柠檬酸刺激了细菌对糖的代谢，提高了乳酸菌生长量和生长速率。糖代谢也改变了柠檬酸的代谢途径，柠檬酸进入细胞后，在柠檬酸裂解酶的作用下分解成乙酸和草酰乙酸；后者脱羧生成丙酮酸，在糖代谢产生的NADH2的作用下，被还原生成乳酸，使共代谢过程中，柠檬酸代谢产物中乳酸产率提高。
不同属的苹果酸-乳酸菌及同属的不同菌株，发酵特性均不相同，酒类酒球菌在苹果酸-乳酸发酵期间，柠檬酸的降解与苹果酸的降解相比被延迟，柠檬酸代谢最主要的呈香副产物是双乙酰及其衍生物乙偶姻，生成的双乙酰的含量在其阈值范围之内(小于5mg/L)，有利于葡萄酒风味复杂性的形成，对酒香有一定的增进作用；当其含量超过阈值时，就会使酒出现奶油味，破坏酒的香气。一般果酒中双乙酰的最终浓度取决于SO2浓度。
四、乳酸菌氮代谢及生物胺的形成
在苹果酸-乳酸发酵过程中，由于乳酸菌的生长代谢，精氨酸在苹果酸-乳酸发酵后浓度下降，而鸟氨酸的浓度上升。有些氨基酸在乳酸菌的作用下发生脱羧反应产生生物胺(如组胺和色胺)。已经证明，酒球菌和片球菌属的细菌都能产生生物胺。在发酵食品如酸奶、发酵香肠、泡菜及果酒中，大都含有生物胺。胺在生物活性细胞中具有重要的生理功能。但当人体吸收过量的生物胺时，可能会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等过敏性反应。生物胺在人体细胞内会被一些酶促代谢反应降解，但酒精和乙醛能抑制这些酶的活性。
1．精氨酸
精氨酸具有苦味、霉味，通过细菌对精氨酸的降解，有助于消除这些异味，同时还可以从一定程度上提高酒的pH，从而提高了酒的感官品质，产生的鸟氨酸还有抑制野生酵母的作用。但是代谢产物瓜氨酸可作为生成致癌物质——氨基甲酸乙酯的前体物，严重影响果酒的饮用安全性。精氨酸代谢研究日益受到重视。
直至20世纪90年代，研究者仍对苹果酸乳酸菌的精氨酸代谢途径存有争议。一种说法是酒类酒球菌精氨酸代谢途径是尿素循环途径：精氨酸在精氨酸酶的作用下转化成鸟氨酸和尿素，随后鸟氨酸在鸟氨酸转氨甲酰酶的作用下转化成瓜氨酸；尿素在脲酶的作用下生成氮和二氧化碳。但刘芳在精氨酸代谢实验中发现，在整个细菌培养过程中并没有检测到尿素，并且在细菌的无细胞抽提物中也没有检测到精氨酸酶和脲酶的活力。因此，可以肯定苹果酸乳酸菌对精氨酸的降解不是尿素循环途径。在实验中，他们也发现，精氨酸经布氏乳杆菌分解后生成的瓜氨酸又被细胞同化，并且随着瓜氨酸含量的降低，鸟氨酸含量上升。这表明，瓜氨酸是鸟氨酸的前体，而不是鸟氨酸的降解物。并且在酒类酒球菌等的无细胞抽提物中，检测到了与苹果酸乳酸菌的精氨酸代谢有关的3个关键酶：精氨酸脱亚氨基酶、鸟氨酸转氨甲酰酶和氨基甲酰激酶，提出了苹果酸-乳酸菌的另一种途径，精氨酸代谢的脱亚胺途径。
2．生物胺
由于苹果酸-乳酸菌的生长代谢，会使酒中的氨基酸含量发生显著变化。某些氨基酸在葡萄酒苹果酸-乳酸菌相关酶的作用下发生脱羧反应，可生成相应的胺类化合物。组胺的产生不仅与菌株特性有关，也取决于前体物的数量及存在的酵母菌皮的作用，这些因素增加了介质中组氨酸的含量。控制细菌生长速率和总生物量的乙醇、pH也是很重要的因素。低pH和低乙醇浓度促进组胺的产生，特别是在营养最贫乏(无葡萄糖、无L-苹果酸)的条件下，可能会导致组胺的大量产生。
乳酸菌对氨基酸脱羧产生生物胺需要两个基本条件：一是乳酸菌具有氨基酸脱羧酶活力，不同种间和菌株间的乳酸菌，氨基酸脱羧能力差异很大；二是基质中有足够的氨基酸。因为酵母在酒精发酵过程中改变了果汁中的含氮化合物的组成，它们能够利用有些氨基酸，也能通过酵母的自溶作用释放一些氨基酸。在酒精发酵结束后与酵母酒脚一起贮存，酵母自溶释放的多肽和游离氨基酸能够被乳酸菌水解和脱羧，这也解释了为什么带酒脚贮存的果酒中生物胺含量通常较高的原因。
苹果酸-乳酸发酵结束后，酒中所有的乳酸菌都变成了有害菌，乳酸菌群体数量并不迅速下降，应及时除去，以防止乳酸菌利用氨基酸生成生物胺。可以采用的工艺方法如下：
①添加足够的SO2。苹果酸-乳酸发酵结束后立即调整SO2至100mg/L或游离SO2至30mg/L。较高浓度的SO2可以抑制乳酸菌的生长，该方法简单、有效，在生产上广为采用。②尽早下胶、倒罐、去酒脚、澄清或进行瞬时高温灭菌。③在15℃左右低温贮酒。④添加化学抑制剂，美国允许在葡萄酒中添加富马酸(0.5g/L)抑制细菌的生长；添加细菌素，乳酸链球菌素、植物乳杆菌素和片球菌素可以抑制乳酸菌的生长。酒类酒球菌对乳酸链球菌素非常敏感，5U/mL的乳酸链球菌素可完全抑制其生长，植物乳杆菌素可以抑制多种乳酸杆菌，片球菌素可以抑制片球菌。⑤添加溶菌酶。该酶对乳酸菌具有很好的溶菌效果，随着pH的增加，酶活增强，使用溶菌酶可以降低SO2的用量而且不影响果酒的感官质量。溶菌酶的用量为125～500mg/L。
细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的前体多肽、多肽或蛋白质，当其达到一定数量时可以抑制或杀灭与之相同或相似的其他微生物，通常其所产细菌素不会对菌体本身造成伤害。乳酸菌通常被认为一般公认安全，而且大多数的产细菌素乳酸菌来源于天然食品，因此乳酸菌细菌素更适合在食品中应用，具有良好的pH稳定性、热稳定性及对酸、盐、酶的耐受性，乳酸菌细菌素具有高效、广谱、安全等优点，能有效地抑制食品中的致病菌和腐败菌，是一种具有巨大应用潜能的生物防腐剂。
五、乳酸菌与其他微生物间的相互作用
接种的乳酸菌会与其他细菌(pH条件有利于其生存生长)相互作用。这些细菌会产生细菌素(如对乳酸菌有毒害作用的多肽或蛋白质)，严重阻碍苹果酸-乳酸发酵的进行。酵母菌与乳酸菌之间存在的拮抗作用主要通过对营养物的竞争和分泌抑菌物质(如SO2、中链脂肪酸或多肽)来实现。这种抑菌效应取决于果酒中天然存在脂肪酸的含量，较低pH会增强拮抗作用。此外，酵母还会通过自溶作用产生一些刺激苹-乳发酵的代谢物，因此，利用酵母菌和乳酸菌之间的相互作用成为苹-乳发酵至关重要的一步。酵母的营养需求越大，消耗发酵醪中的营养物越多，对乳酸菌的接种和存活影响越大。酒精发酵结束后补充半胱氨酸和谷胱甘肽能够刺激乳酸菌的生长。另外，酒精发酵过程中补充均衡复杂的营养组分(含氨基酸)会延缓酵母对氮源的同化作用，抑制酵母对发酵醪中氨基酸的过度消耗，为乳酸菌生长保留充足的重要氨基酸组分。法国拉曼集团通过研究不同微生物之间的相互作用，研究出困难条件下或针对不同葡萄品种最适合的酵母和乳酸菌组合，接种采用YSEO工艺流程，一种特殊酵母生产流程，此工艺的目标是使发酵更安全，优化提升葡萄酒感官品质，尤其可以提高酵母在发酵时对外界不良条件的抵抗力，如高酒精度，从而保证发酵顺利启动、安全结束，并产生更多有益的组分，降低不良副产物。此工艺生产的酵母菌后，更易于触发苹-乳发酵，促进乳酸菌的生长。国内有酒厂使用YSEO酵母与乳酸菌同时接种，能进一步缩短苹-乳发酵时间，效果显著。这主要是由于在困难条件下能彻底发酵的YSEO酵母对营养物需求较低，释放的抑菌物质(如SO2)较少。
六、乳酸菌的新陈代谢
乳酸菌的新陈代谢有以下3个阶段，每个阶段呈现不同的特性。
① 细胞繁殖阶段 利用糖作为能量来源。此时，不消耗苹果酸或柠檬酸，但却产生一定的醋酸。
② 稳定阶段Ⅰ 乳酸菌不利用糖，苹果酸被转化成乳酸。此时，既不分解柠檬酸，也不产生醋酸。
③ 稳定阶段Ⅱ 此时既不降解糖，也不分解苹果酸，但乳酸菌消耗柠檬酸生成丁二酮。要阻止或控制此阶段的发生和进行，可以通过加入SO2或溶菌酶来实现。