任务3 器皿的洗涤、包扎与灭菌

学习要求

1.了解微生物实验中玻璃器皿洗涤的重要性。

2.掌握玻璃器皿的洗涤、包扎的方法。

3.掌握玻璃器皿的灭菌原理及方法。

知识准备

一、玻璃器皿的洗涤

微生物实验是纯种培养，必须是无菌的。因而微生物实验需要的所有的玻璃器皿，无论是新购置的还是使用过的，都必须经过仔细的清洗和严格的灭菌后才能使用。清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。

1.微生物学实验常用的玻璃器皿

主要有试管、吸管、培养皿、三角瓶、载玻片、盖玻片等，都需要经过清洗，达到无灰尘、无油垢和无机盐等杂质后，才能保证获得正确的实验结果，有的器皿还需经包装、灭菌后方能使用。

2.洗涤剂的种类及应用

（1）水 水是最重要的洗涤剂，但只能洗去可溶解于水的沾污物。油、蜡等不溶于水的沾污物则必须用其他方法处理后，再用水洗。对于要求无杂质颗粒或无机盐离子的玻璃器皿，在用清水洗过后，应再用蒸馏水进行漂洗。

（2）肥皂 肥皂是常用的很好的去污剂。对有油污的器皿，通常用湿刷子涂抹一些肥皂后，刷洗器皿，再用水清洗。5%热肥皂水去油污能力也很强。

（3）洗衣粉 洗衣粉有很强的去污、去油能力。用1%的洗衣粉溶液洗涤玻璃器皿，特别是洗涤带油的载玻片和盖玻片，如果加热煮沸，则有很好的清洁效果。

（4）去污粉 主要作用是摩擦去污，也有一定的去油污作用，用时先将器皿湿润，再用湿布或湿刷子沾上去污粉擦拭去污垢，然后用清水洗掉去污粉。

（5）洗涤液 重铬酸钾（或重铬酸钠）的硫酸溶液，是一种去污能力很强的强氧化剂，常用于玻璃或搪瓷器皿上污垢或有机物的清洗，但不能用于金属器皿。配好的洗涤液可多次使用，每次用完后倒回原瓶中保存，直至溶液变为青褐色时才失去效用。使用洗涤液应尽量避免混入水分稀释。将洗涤液加热至40～50℃后使用，可以加快作用速度，用洗涤液洗过的器皿，应立即用清水冲洗干净。当器皿上带有大量有机物时，应先将器皿上的有机物尽量清除后，再用洗涤液洗涤，否则洗涤液很快失效。

洗涤液具有强腐蚀性，溅在桌椅上时应立即用水洗并用湿布擦拭，皮肤及衣服上沾有洗涤液时，应立即用水冲洗，然后用苏打（碳酸钠）水或氨水洗去洗涤液。

（6）浓硫酸与强碱液 器皿上如沾有煤膏、焦油及树脂类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠溶液浸洗，处理所需时间随所沾物质的性质而定，一般只需5～10min，有的需数小时。

（7）有机溶剂 有时洗涤浓重的油脂物质及其他不溶于水也不溶于酸或碱的物质，需要用特定的有机溶剂。常用有机溶剂有汽油、丙酮、酒精、苯、二甲苯及松节油等，可根据具体情况选用。

二、玻璃器皿的灭菌

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃）、时间长（1～2h）。

三、注意事项

灭菌物品不能有水，否则干热灭菌中易爆裂；灭菌物品不能装得太挤，以免影响温度上升；灭菌温度不能超过180℃，否则棉塞及牛皮纸会烧焦，甚至是燃烧；自然降温至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因突然降温导致玻璃器炸裂。

材料用具

试管、各种规格的玻璃吸管、培养皿（平皿）、三角瓶及烧杯、玻璃涂布棒、装培养皿的金属筒、干热灭菌箱等。

任务实施

一、玻璃器皿的洗涤

1.新购置的玻璃器皿的洗涤

新购置的玻璃器皿一般含较多的游离的碱，可在2%的盐酸或洗涤液内先浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，倒置在洗涤架上，晾干或在干燥箱内烘干备用。

2.使用过的玻璃器皿的洗涤

（1）试管、培养皿、三角瓶、烧杯的洗涤 可先用瓶刷（或试管刷）沾用洗衣粉或去污粉等刷洗，然后用自来水冲洗干净。洗涤后，要求内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，如还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗干净。

①装有固体培养基：刮掉，洗涤。

②带菌的器皿：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24h或煮沸0.5h，然后洗涤。

③带病原菌培养物的器皿：先高压蒸汽灭菌，倒去培养物后再洗涤。

（2）玻璃吸管的洗涤 吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗。

①吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。

②塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗。

③吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24h然后洗涤。

④吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗。

（3）载玻片和盖玻片的洗涤

①玻片上有香柏油：先用二甲苯溶解油垢，再在肥皂水中煮沸10min左右，用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡1～2h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水淋洗，等干燥后用95%乙醇中保存备用。

②检查过活菌的：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述方法洗涤。

二、玻璃器皿的包扎

在微生物学工作中需要无菌的玻璃器皿，如无菌吸管、无菌培养皿等，这些玻璃器皿在灭菌之前需要进行隔离包装，常用的包装方法有以下几种。

1.培养皿的包装

洗净干燥后的培养皿，可放在特制的金属容器中灭菌，或可按6～10套培养皿为一组，用旧报纸卷起来，将两端封严，再进行灭菌。

2.吸管的包装

无菌操作用的吸管经洗净干燥后，首先在吸管上端的管口内塞棉花，作为隔离及过滤杂菌之用。棉柱长度不少于1cm，一般用脱脂棉为宜，用量根据吸管口径大小而定，以塞得不紧不松为宜，棉花不能弄湿，以免影响空气的流通和滤菌效果。塞好棉塞后用纸条卷起包好（图1－1），先将旧报纸裁成5cm宽的长纸条，再从吸管尖端开始封住后卷起卷至吸管上端3～4cm处即可，留一小段露在纸卷外，可用浆糊将纸粘住。注意不要卷得太紧，以免使用时不易抽出；也可将吸管顶端完全包住，再将纸卷末端折回固定。也可用金属制成的专用圆筒，将塞好棉柱的吸管成批放入，吸管上端向外，盖好圆筒盖，经灭菌后随时抽用，较方便。

3.试管和三角瓶等的包扎

（1）方法 试管口和三角瓶口用棉花塞或泡沫塑料塞塞住，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸与细线扎好。

（2）棉塞的制作技术

①棉塞的作用和要求：一般情况下，培养微生物用的试管和三角瓶口均需加棉塞，其作用是既要保持空气的流通，以保证供足微生物生长所需的氧气，又要滤除空气中的杂菌，避免污染。

制作棉塞的基本要求是：松紧适度，太紧影响通气，太松则影响过滤除菌的效果。插入的部分长度要恰当，一般为容器口径的1.5倍，过短则易脱落。外露部分应略为粗大些，且比较整齐硬实，便于手握取。

②棉塞的制作方法：制作棉塞应采用普通棉花，脱脂棉易吸水不宜用。制作方法多种多样，下面仅介绍一种作参考。

根据所做棉塞的大小，选取一块棉花，铺平成长方形，把长边的两头各叠进一段，使其叠齐加厚。按住短边把棉花卷起来，卷时两手紧捏中间部分，两头不要卷得太紧，卷成棉卷后，从中间折起并拢（图1－2），插入试管或三角瓶中，深度如要求中所述（图1－3）。新做的棉塞弹性比较大，不易定形。插在容器上经过一次加压蒸汽灭菌后形状和大小便基本可固定。为了便于无菌操作，减少棉塞的污染几率，延长棉塞的使用时间，可在棉塞外面包上1～2层纱布，并用棉线扎住纱布断口（图1－4）。

三、玻璃器皿的灭菌

干热灭菌法：用干燥的热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。

1.适用范围

适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌，带有胶皮的物品、含水分的物质、培养基等不可用这种方法。

2.方法

（1）装箱 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。

（2）升温 接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。

（3）恒温 当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度1～2h。

（4）降温 切断电源，冷却至60℃。

（5）取物 打开箱门，取出灭菌物品（未降至60℃以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。

【问题思考】

1.玻璃器皿为什么要洗涤、灭菌后再使用？

2.新购置的玻璃器皿需要洗涤吗？

3.玻璃器皿洗涤后挂有水珠说明什么？

4.吸过菌液的吸管怎么洗涤？

5.带油且带菌的载玻片怎么洗涤？

6.干热灭菌的原理是什么？

7.玻璃器皿灭菌时应注意什么？