2.1 二年残孔菌胞外多糖

2.1.1 菌种及培养基

二年残孔菌为西南科技大学贺新生教授提供，为野生子实体的组织分离菌丝体培养物，现保存于郑州轻工业学院发酵工程研究室。

①PDA培养基：200g去皮土豆，20g葡萄糖，108g琼脂，蒸馏水补至1000mL，pH自然。

②基础培养基：30g葡萄糖，3g酵母粉，蒸馏水补至1000mL，pH自然。

2.1.2 培养条件的优化

（1）菌种活化 将保存的试管斜面菌种转接PDA平板，26℃恒温培养7d。

（2）种子液的制备 用打孔器打取活化好的两种真菌菌丝块（约1cm²）两块接入含50mL种子培养液的250mL三角瓶中，摇瓶转速为160r/min，于26℃振荡摇床中培养4d。然后加入无菌玻璃珠，置于磁力搅拌器上将菌丝块打碎后备用。

（3）最佳培养时间的确定将二年残孔菌和虎皮香菇分别培养12d和14d，每隔2d测定两种真菌的菌丝干重和胞外多糖产量。

（4）葡萄糖标准曲线的制作 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1.02g，置于100mL容量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀，即为葡萄糖标准母液。精确量取1mL母液移至100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，即为葡萄糖标准液。精确吸取标准品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于具塞试管中，分别补蒸馏水至1mL，再各加入5%的苯酚水溶液1mL和浓硫酸5mL振荡摇匀，先在沸水浴中15min，取出后立即置于冰水浴中15min。以加入0mL葡萄糖标准液的反应液作为空白对照调零，于490nm下测各反应液的吸光度值，回归分析数据。

（5）菌丝干重和胞外多糖含量的测定 菌丝干重的测定 将培养物进行抽滤得到菌丝体，将其置于70℃的烘箱中，烘干称重，为菌丝干重。胞外多糖的提取：在除去菌丝后的发酵液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃沉降过夜，离心取沉淀，即不溶于乙醇的发酵胞外多糖。用蒸馏水溶解多糖沉淀，定容至50mL。胞外多糖的测定：取1mL加到试管中，分别加入1mL 5%的苯酚水溶液和5mL浓硫酸，余下操作同2.2.4。测定并记录反应液在490nm的吸光度值，从标准曲线上计算得到样品液相对应的胞外多糖量。每个处理3次重复，求其平均值。

（6）单因素试验确定最佳摇瓶培养条件

①碳源利用试验：分别用果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、山梨醇代替基础培养基中的葡萄糖，接种后26℃恒温振荡培养，摇床转速为160r/min，探究不同碳源对两种真菌菌丝体生长和胞外多糖产量的影响。

②氮源利用试验：采用以上的基础培养基，分别以牛肉膏、蛋白胨、多价胨、胰蛋白胨、大豆粉、酵母粉、尿素、（NH₄）₂SO₄、NaNO₃为氮源，接种后26℃恒温振荡培养，摇床转速为160r/min，探究不同氮源对两种真菌菌丝体生长和胞外多糖产量的影响。

③无机盐试验：在基础培养基中分别添加5mmol/L的MgSO₄、KH₂PO₄、MnCl₂、NaCl、CaCl₂、FeSO₄和自来水，接种培养后，测定各个锥形瓶中的菌丝干重和EPS产量。

④pH试验：使用1mol/L的HCl和NaOH调节培养液pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10，接种培养后，测定不同pH条件下各实验组的菌丝干重和EPS产量。

（7）交互作用试验 在单因素实验基础上，探究碳源浓度和碳氮比对两种真菌胞外多糖含量的影响。碳源浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%；碳氮比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。每组实验设三个平行，培养时间分别为8d和12d，摇床转速为160r/min，温度为26℃。（8）旋转单一法确定二年残孔菌发酵罐的胞外多糖的最佳培养条件 旋转单一法是一种自动校准最佳处理方法。此方法由单纯的响应面引导参数的改变，并自动校正。该方法进行过程中，每组实验的变量组合都是在上一组实验结果的基础上确定，并且继续该过程直到得到的终的变量最佳组合。本实验中起初的四组实验以C/N比、通气率和搅拌速度为关键变量，根据实验结果舍弃反应最差的，用新一组的实验代替新一轮的四组实验，直至多糖含量下降停止实验。新的实验组合的参数应设定：

N＝2 ×（B₁+B₂+B₃）/3 －W

N表示新的实验组合；B₁，B₂和B₃表示前面4个实验中的3个较好组合的参数设定值，W表示前面4个实验中最差的参数设定值。

（9）均匀设计法确定虎皮香菇产胞外多糖的发酵培养最佳培养条件 根据单因素实验的结果确定影响虎皮香菇EPS产量的主要因素，通过预实验确定各因素的使用量，使用DPS v7.05设计实验方案。

2.1.3 培养条件优化结果

（1）二年残孔菌培养周期的确定 在培养时间内，观察二年残孔菌的菌丝干重和EPS产量的变化，随着时间的增加，二年残孔菌的菌丝干重和EPS产量均有所增长，但第8天以后菌丝干重仍在增加而EPS产量明显下降（图2.2），这可能是由于菌丝量达到一定生长高峰期后，多糖成分作为养分供应菌丝增长而被消耗。综合考虑，确定二年残孔菌的培养周期为8d，此时胞外多糖的含量最高。

（2）单因素试验优化二年残孔菌培养条件 不同碳源对二年残孔菌的菌丝干重和EPS产量均有影响，综合考虑菌丝干重和EPS产量，确定最佳碳源为麦芽糖；在氮源试验中，有机氮源几乎都优于无机氮源，大豆粉增加了菌丝干重，这可能是由于大豆粉不完全溶解，不溶物影响了菌丝干重的测定，综合考虑，确定其最佳氮源为蛋白胨；培养基中添加不同的无机盐，目的为了增加菌丝干重和EPS产量，FeSO₄明显提高了EPS产量但对于菌丝干重不增反而减少，故选择KH₂PO₄作为添加最适宜生长的无机盐（图2.3）。

pH对二年残孔菌的菌丝生物量和EPS产量影响显著，pH为5时EPS产量最高，菌丝生物量也较高。当碳源浓度为4%时，菌丝干重和EPS含量达到最大。合适的碳源浓度不仅关系菌丝的生长，还显著影响EPS的积累，碳源过多，则容易形成较低的pH；碳源不足，则容易引起菌体衰老和自溶；在碳源浓度为4%的初始条件下，C/N比为5时EPS产量最大，菌丝干重也显著提高（图2.4）。一般而言，C/N比例不当会影响菌体摄取营养物质，从而直接影响菌丝体的生长和产物的合成，由于碳源既可作碳源又可作能源，因此一般用量比氮源多，综合以上实验结果，在后续实验中选取pH 5，碳源浓度4%，C/N比为5作为最佳培养条件。

（3）旋转单一法优化二年残孔菌产胞外多糖发酵罐培养条件在最初的4个实验中，参数的水平根据预实验分别设定：C/N比为5～15；通气量为1.0～2.0vvm；搅拌速率为100～250r/min。从表2.1中的实验2和实验4可以看出，较低的C/N比和较高的搅拌速度，胞外多糖的产量较低；且较高的通气率和较高的搅拌速度（实验2）并没有增加胞外多糖的产量。这说明提高胞外多糖的产量需要C/N比、通气率和搅拌速度三者之间的平衡。

旋转单一法实验结果表明，二年残孔菌最佳发酵参数组合为第5组实验：C/N比为18.33，通气率控制在0.67vvm，搅拌速度设定为50r/min。在最佳实验条件下，胞外多糖产量比优化前提高了3倍，达13.09g/L（表2.1）。

（4）小结 通过单因素实验，优化了二年残孔菌和虎皮香菇的摇瓶培养条件。二年残孔菌摇瓶产EPS的最佳条件：40g/L麦芽糖，8g/L蛋白胨，5mmol/L KH₂PO₄，培养时间8d，pH为5；在此基础上，选用C/N比、通气率和搅拌速度三个因素，运用旋转单一法对二年残孔菌的发酵罐培养条件进行优化，当C/N比为18.33，通气率为0.67vvm，搅拌速度为50r/min时，胞外多糖产量可达13.0932g/L；虎皮香菇摇瓶产EPS的最佳条件为60g/L乳糖，4g/L酵母粉，培养时间为12d，pH为5。发酵罐培养优化中，运用均匀设计法对虎皮香菇的C/N比、通气率和搅拌速度三个因素进行优化，当C/N比为25，搅拌速度为202r/min，通气率为1.5vvm时，胞外多糖产量最高，达56.58g/L。

2.1.4 二年残孔菌深层发酵培养的形态学和流变学

发酵过程中，真菌的菌丝体形态特征与菌体的生物活性及代谢产物的积累关系紧密，因而常被作为一个关键指标。不同真菌的菌丝形态不同，所产生的代谢产物也各不相同，如黑曲霉（Aspergillus niger）产柠檬酸时需以菌丝球的形式存在，而产淀粉酶时需要黑曲霉分散的丝状体。对大多数真菌来说，其发酵产物产量依赖于一种最适宜的生长形态。因此，为了得到和控制最适宜的菌丝形态以获得最大真菌多糖的产量，就必须搞清发酵条件与真菌形态的关系。

真菌的发酵液流变特性是发酵体系中的一种宏观动力学特性，是发酵体系结构的表征，会随发酵过程出现复杂的变化，因此，流变学特征严重影响发酵罐醪液的传质、传热过程以致改变菌丝体的生理、生态环境，影响菌丝体的代谢与形态（如真菌多糖的分泌），也必然影响发酵过程的生长动力学及发酵工艺的控制与优化。同时，培养基的配制、优选对发酵醪液流变学特性也有重要的影响。所以，在一定的发酵条件下，流变学特性对真菌发酵过程中的影响至关重要。

本工作利用5L搅拌式发酵罐培养二年残孔菌，研究形态学（菌丝球平均直径、粗糙度、圆度、紧密度）、流变学（黏度）及它们与菌丝干重、EPS产量的关系。研究真菌胞外多糖形态学、流变学特性，旨在进一步丰富真菌胞外多糖的理论体系，为两种真菌的规模化生产提供理论依据。

（1）培养基 二年残孔菌优化培养基：40g/L麦芽糖，2.18g/L蛋白胨，5mmol/L KH₂PO₄，pH5，补水到1000mL。

二年残孔菌未优化培养基：40g/L麦芽糖，8g/L蛋白胨，5mmol/L KH₂ PO₄，pH5，补水到1000mL。

（2）发酵罐培养 5L发酵罐装入优化或未优化培养基3.5L，离位灭菌后冷却接种。设置发酵罐控制参数：二年残孔菌C/N比为18.33和5.0，通气率为0.67vvm和2.0vvm，搅拌速度设定为50r/min和250r/min；虎皮香菇C/N比为25和5，通气率为1.5vvm和3.0vvm，搅拌速度为202r/min和150r/min。自接种开始，每隔48h，取样一次，一次取3个平行。

（3）样品的处理流程 样品的处理流程见图2.5。

（4）两种真菌形态学的研究 显微镜下观察菌丝球形态后，通过DT2000图像分析软件分析，根据菌丝球的平均直径、菌核面积、菌丝球面积、菌丝球周长、圆度等参数计算出粗糙度、紧密度。公式如下所示：紧密度＝菌核面积/菌丝球面积；粗糙度＝（菌丝球的周长）²/面积×4π。

在菌丝球染色时，先加入与发酵液等体积的固定剂和少许染色剂，在4℃冰箱温度下放置1d，然后用蒸馏水多次冲洗染色的菌丝体，将其放在载玻片上，待晾干后在40倍显微镜下拍照观察。固定菌丝球或对菌丝球进行染色操作时，可事先低速离心，以除去多余发酵液或固定剂，节约试剂。

（5）两种真菌流变学的研究 测定样品发酵液黏度时应注意使样品混合均匀，选择合适的转子及转速并记录，黏度＝黏度计读取数值×相对应转子系数（相关系数与使用的转子、转速之间的关系见表2.2）。

（6）二年残孔菌发酵罐培养形态学、流变学变化 优化发酵条件下，随着时间的增加二年残孔菌菌丝球逐渐变大，低搅拌速度下菌丝球直径变得较大、紧密。在未优化发酵条件下，搅拌速度较高，菌丝球直径较小并趋于松散，丝状体所占比例大，第2天就出现菌核，但是菌丝球较小（图2.6）。这可能是由于二年残孔菌对剪切力敏感，搅拌速度太高，菌丝易断裂成碎片，导致细胞破裂，发酵罐中丝状体含量的增加，不利于溶解氧和营养物质的传递，导致菌丝球生长不大。该真菌在发酵培养过程中菌丝球紧密度、直径、粗糙度和圆度的变化见图2.7。

如图2.6和图2.7所示，发酵第0～4天，在优化条件下菌丝球生长较快，平均直径与未优化条件下相比变化明显；而菌丝形态差异不明显。随着发酵时间的延长，两种发酵条件下的菌丝形态在紧密度、圆度和粗糙度上差异明显：最佳条件下的菌丝球表面光滑，且完整度好；而在未优化发酵条件下的菌丝球周围粗糙，圆度也偏小。这可能是由于二年残孔菌对搅拌产生的剪切力敏感。

如表2.3和表2.4所示为二年残孔菌菌丝球形态学参数与EPS产量和菌丝干重之间的相关性系数表。在优化和未优化发酵条件下，菌丝干重和EPS产量均呈正相关（P＜0.05）；菌丝球的紧密度和粗糙度分别在优化和未优化发酵条件中与菌丝干重和EPS含量呈正相关，但无显著差异；菌丝球的平均直径在优化培养基中与菌丝干重呈正相关（P＜0.01），与EPS产量呈正相关（P＜0.05），在未优化发酵条件中与菌丝干重和EPS产量呈负相关，但无显著差异；菌丝球的圆度在优化发酵条件中与菌丝干重和EPS产量均为负相关性，并无显著差异，这可能是因为搅拌速度加快细胞内多糖的释放，菌丝形态发生变化，使得发酵液中多糖含量增加。

如图2.8和图2.9所示，在一定的范围内，随着发酵时间的增加，菌丝的黏度、菌丝生物量和EPS产量均有所提高。发酵第6天，在优化发酵条件下，发酵液黏度急剧上升，说明此时二年残孔菌进入快速生长时期，胞外多糖量也随之增加，这与图3.5（1）中的菌丝干重和EPS产量变化趋势一致。优化发酵条件下，第6～8天发酵液黏度下降，可能是由于菌体产生的多糖酶把多糖分解成小分子，被分解的多糖超过产生的多糖造成黏度下降。崔凤杰等人报道发酵液的黏度与菌丝体的生物量以及胞外多糖的浓度相关，本工作的研究与其报道一致。

如表2.5和表2.6所示是二年残孔菌发酵液黏度与菌丝干重和EPS产量相关系数表。从表可知，发酵液的黏度与菌丝干重和EPS产量的值有关，且在优化发酵条件下，发酵液黏度与EPS产量有极显著的相关性（P＜0.01），与菌丝干重有显著相关性（P＜0.05）。

2.1.5 胞外多糖产量和结构

（1）试验方法 选用摇瓶优化后的培养基，探究非离子表面活性剂和有机溶剂对两种真菌胞外多糖产量的影响。非离子表面活性剂设3个处理［0.1%（体积分数）］：吐温40、吐温60、吐温80；有机溶剂设4个处理［0.3%（体积分数）］：丙酮、氯仿、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）。在发酵中后期添加表面活性剂和有机溶剂（二年残孔菌在第6天添加，虎皮香菇在第8天添加）。

用适量的蒸馏水完全溶解发酵液中醇沉的粗多糖，然后加入除蛋白液（氯仿/正丁醇＝5∶1），使多糖溶液与除蛋白液体积比（3∶1）。将粗多糖与除蛋白液的混合液置于磁力搅拌器上搅拌20min，使其充分混合均匀，放在分液漏斗上萃取30min，去除水层与溶剂层交界处的变性蛋白，留下水相，反复几次，直至溶剂层与水的界面无沉淀为止。将所有水相混合浓缩后加入4倍体积的无水乙醇，在4℃下过夜沉淀后弃去上清，多糖沉淀置于冷冻干燥机中干燥，得到两种真菌不同处理的粗胞外多糖。

用去离子水平衡Sepharose CL－6B层析柱24h，流速为1.5mL/min。称量120mg粗胞外多糖，溶于3mL 0.2mol/L的NaCl溶液中，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤后通过Sepharose CL－6B凝胶柱层析，洗脱液为0.2mol/L NaCl溶液，流速为1mL/min，利用自动收集器收集，每管5mL，洗至无糖。用苯酚硫酸法检测收集到的溶液多糖，并用紫外分光光度计在波长280nm处直接检测蛋白。重复过层析柱6次，每次都用苯酚硫酸法收集多糖组分。将收集到的组分用旋转蒸发仪浓缩至10mL，再用分子质量为8000～14000ku的透析袋透析72h除去多糖溶液中的NaCl，每隔8h换一次蒸馏水，最后将透析过的精制胞外多糖真空冷冻干燥以备后续试验使用。

①精制胞外多糖的气相分析：

a.标准品的测定：精密称取0.005g精制胞外多糖组分于棕色小瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸3mL，密封后放入121℃恒温箱中2h，之后用0.22μm的水相滤膜过滤，再用旋转蒸发仪把滤液蒸干，加入2mL甲醇蒸干，重复蒸干3次。往蒸干的棕色小瓶加入1mL的吡啶，再加入0.1mL的BSTFA∶TMCA（99∶1）密封置于80℃恒温箱2h。溶液冷却后用有机膜过滤，滤液加到气相小瓶后待测。另外称量0.005g鼠李糖、海藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖于棕色小瓶中，加入1mL吡啶与0.1mL的BSTFA∶TMCA（99∶1）密封置于80℃恒温箱2h。溶液冷却后用有机膜过滤，滤液加到气相小瓶后待测。

b.色谱条件：HP－5 MS 60m色谱柱，升温程序：起始温度80℃，以5℃/min的速度升温至280℃，保持20min。进样量1μL，分流比5∶1，延迟时间10min，进样口280，传输线280。

②精制胞外多糖的红外光谱分析：取1～2mg精制多糖，用适量溴化钾（KBr）压片，在4000～400cm^－1区间内用傅里叶变换红外光谱仪扫描IR吸收。

③刚果红实验：称取5mg多糖加入2mL蒸馏水和2mL 80μmol/L刚果红，然后慢慢逐滴加入1mol/L的NaOH溶液，使溶液中NaOH浓度从0逐渐升高到0.5mol/L，室温放置10min，以不加多糖样品的刚果红溶液作为空白，用紫外可见光谱仪在400～600nm范围内进行扫描，测得各NaOH浓度条件下的最大吸收波长。以NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标，作出曲线图。

④胞外多糖的热重分析：将精制胞外多糖研磨成粉末，取5～10mg上样。样品温度由室温升高到900℃，升温速度为10℃/min。

⑤凝胶渗透层析法测定不同条件下胞外多糖的相对分子质量：将Sepharose CL－6B填入2.5cm×60cm层析柱中，用0.2mol/L NaCl溶液按1.5mL/min的恒定流速平衡24h，先用蓝色葡聚糖测得外水体积V₀，将浓度为40mg/mL的各种不同分子质量的标准葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）2mL分别相继上样，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，每管5mL分部收集，苯酚硫酸法显色，合并洗脱液，求得洗脱体积Ve，Vt为凝胶柱所能容纳的总体积，分别计算出各标准多糖的分配系数K_av值，K_av＝（Ve－V₀）/（Vt－V₀），以K_av为横坐标，LogM为纵坐标做标准曲线。在相同条件下测出二年残孔菌和虎皮香菇胞外多糖的Ve，由标准曲线求得不同条件下两种真菌胞外多糖的相对分子质量。

（2）表面活性剂和有机溶剂处理对二年残孔菌菌丝体干重和胞外多糖产量的影响 相同的原料采用不同方法提取所得的多糖结构有差别，来源于不同组织所得的多糖结构也有差异。如图2.10所示，添加表面活性剂吐温40和吐温60对菌丝生长有促进作用，但EPS含量下降，添加吐温80后提高了EPS产量。有机溶剂试验中，添加丙酮二年残孔菌EPS产量最高，比对照提高45.6%，说明添加有机溶剂丙酮有利于二年残孔菌EPS的积累。因此，表面活性剂选用吐温80、有机溶剂选用丙酮进行后续实验。

（3）胞外多糖的纯化 二年残孔菌不同处理下得到的胞外多糖粗品通过Sepharose CL－6B层析柱分级纯化，用苯酚硫酸法测多糖含量。结果表明不同处理下二年残孔菌的洗脱峰均为单一峰，且峰形对称（图2.11），故收集的组分为单一物质。

（4）不同处理条件下二年残孔菌胞外多糖的单糖组分分析 单糖的组成分析是糖分析中的一项重要内容，是研究多糖结构的关键，也为进一步研究多糖的化学结构提供参考。将不同处理下二年残孔菌的精制胞外多糖峰与气相数据库中的单糖峰进行比对，丙酮、吐温80处理后的二年残孔菌胞外多糖和对照组的胞外多糖中，单糖含量最高的均为甘露糖和葡萄糖，但丙酮处理后的EPS仅含有7种单糖，缺少D－（+）－半乳糖。说明二年残孔菌经表面活性剂和有机溶剂处理后单糖种类和含量均发生了变化。据报道，含有D－阿拉伯糖基和甘露糖基分支的D－葡聚糖具有较强的抗肿瘤活性（表2.7）。

（5）不同处理下二年残孔菌胞外多糖的红外光谱分析 丙酮和吐温80处理前后的二年残孔菌胞外多糖的红外光谱分析结果如图2.12和表2.8所示。结果表明，在4000～650cm^－1呈多糖类物质的特征吸收。3265.8cm^－1、3265.5cm^－1、3268.8cm^－1处有宽展圆滑强吸收峰，为O－H伸缩振动；2928.2cm^－1处有较强的吸收峰，说明多糖分子中含有较多的甲基和亚甲基，也说明了多糖分子链较长，分子质量大；对照组中2929.8cm^－1和1446.0cm^－1、经吐温80处理EPS的2928.2cm^－1和1443.8cm^－1出现的吸收峰表明有—CH₂基的存在；2344.2cm^－1和2361.6cm^－1处的吸收峰为C—H键的变角振动峰；1630.4cm^－1、1630.3cm^－1和1632.5cm^－1是乙酰氨基（—NHCOCH₃）的C ═O伸缩振动吸收峰；1300～950cm^－1的一组峰是吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰；922.7cm^－1、921.1cm^－1和922.1cm^－1处的吸收峰，为β－型吡喃葡萄糖的吸收峰；844.1cm^－1、846.2cm^－1和841.9cm^－1处的吸收峰为α－型吡喃环中的C—H键的变角振动；754.6cm^－1和756.8cm^－1为α－D－木吡喃糖的特征吸收峰，759.0cm^－1为D－吡喃葡萄糖环的振动吸收峰。由以上分析可知，对照组和丙酮、吐温80处理的二年残孔菌可能同时含有α－型和β－型的吡喃多糖，是非均一组分构成的多糖。但关于二年残孔菌处理前后单糖组成和单糖链接方式还需要进一步研究。

（6）不同处理EPS的刚果红实验结果分析 NaOH浓度较低时，溶液的紫外吸收移向长波，表明多糖可以与刚果红形成络合物，多糖样品有规则的螺旋构象；当NaOH浓度增大到一定程度，最大吸收波长开始下降，多糖的螺旋结构解体，变为无规则的线团形式。如图2.13所示，二年残孔菌经丙酮和吐温80处理后，NaOH浓度小于0.2mol/L时，较刚果红最大吸收波长向长波移动，随着浓度的增大，最大吸收波长下降，且出现相对稳定的区域，说明二年残孔菌经丙酮和吐温80处理后，其多糖具有螺旋结构。二年残孔菌对照组的最大吸收波长较刚果红向长波移动，但随着NaOH浓度的增加，未出现平稳区域，说明对照组的二年残孔菌多糖可能不具有螺旋结构。据文献报道，高分子质量的β－（1－3）－D－葡聚糖的高度有序构象（三股螺旋）对免疫活性的调节至关重要。

（7）不同处理二年残孔菌胞外多糖的热重分析 二年残孔菌胞外多糖在添加丙酮和吐温80后TG曲线相似，均分为明显的3个阶段，第一个阶段在90℃左右有轻微的失重，可能是干燥过程中残留的水分或其他挥发性物质挥发；第二阶段失重在100～500℃范围内，此阶段二年残孔菌多糖失重率在65%左右，这表明该区域是热分解过程的主要阶段，多糖自身发生了剧烈的分解反应。第三阶段失重在500～900℃范围内，此阶段多糖失重率仅为8%左右，失重趋势较为缓慢，为剩余物的缓慢分解，所剩的主要是一些杂质和耐高温的碳化物（图2.14）。

（8）不同处理下二年残孔菌胞外多糖的相对分子质量 不同处理下所得胞外多糖的分子质量也不相同，相对分子质量在1×10⁴～6×10⁴范围内时多糖具有很强的抗肿瘤活力。对照组的二年残孔菌胞外多糖相对分子质量为22.1ku，吐温80和丙酮处理后多糖分子质量发生了变化，吐温80处理的胞外多糖分子质量为40.5ku，丙酮处理的胞外多糖分子质量为55ku（图2.15）。

2.1.6 胞外多糖的生物活性

随着科学技术的迅猛发展和人民生活水平的不断提高，人们对保健品的追求越来越趋向于回归自然。天然药物和保健品的研究开发一直受到国内外专家的关心。真菌多糖作为众多重要生物活性物质中的一类，具有多方面的生物活性和保健功能，是目前人们研究的热点。

自由基（free radical），从化学结构上指含未配对电子的一类基团、原子或分子。诸多研究表明，由于自由基具有高度的生物化学活性，一方面它是机体防御系统的一部分，另一方面也是造成很多疾病的原因，尤其是随着人体的衰老，人体内的自由基清除剂开始减少，更容易引发种种疾病。自由基清除剂是一种能维护人体健康的物质，其能与自由基反应，并有效地清除体内产生多余的自由基。

真菌多糖能够清除体内的自由基，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖血脂、延缓衰老等多种生物活性，被广泛应用于医疗保健领域。到目前为止，从天然产物中已分离出300余种多糖类化合物，其中从食药用真菌中提取的水溶性多糖最为重要。专家预测，对多糖结构和功能关系的深入研究，将产生生物学的新领域，促进其在医学上和工农业上的快速发展及应用。

世界各地的科学家对从食用菌中分离的多糖类物质进行大量研究，证明多种食用菌多糖均具有抑制肿瘤、增强免疫力的生物活性。许多真菌多糖如云芝多糖、香菇多糖等具有抑制肿瘤的作用，且毒副作用小。现代医学药理研究表明：真菌多糖主要通过加强和恢复患者的免疫功能来发挥抗肿瘤作用，灵芝（Ganoderma lucidμm）、香菇（Lentinus edodes）、姬松茸（Agaricus blazei murrill）等大型食药用真菌中的某些多糖组分，尤其是β－D－葡聚糖衍生物，具有激活人体免疫活性细胞（ICC），增加巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞的作用，刺激抗体的产生，达到提高人体免疫力，增强抗肿瘤能力的目的。目前，由于动物实验周期长、成本高及社会道德等问题，运用体外培养法筛选抗肿瘤药物已成为一个非常重要的手段。

本实验应用MTT法对二年残孔菌和虎皮香菇胞外多糖的抗肿瘤作用进行体外实验研究。MTT法测定活细胞及细胞增殖是目前美国国立肿瘤所（NCI）推行的一种抗癌药物体外筛选法，适合于体外的大规模筛选。其原理是活细胞，特别是增殖细胞，在电子耦合剂存在的情形下，能够被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为高度水溶性的橙黄色甲臜产物（formazan），颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，在450nm波长处使用酶标仪测定OD值，间接反映活细胞数量，了解细胞的增殖情况。MTT法由于实验周期短、需要较少的细胞、人为误差比较小，无放射性污染，能获得较精确的资料，且其检测结果与同位素掺入法有良好的一致性，因此成为药物筛选主要手段。

肝癌和成骨肉瘤为发病率高、严重危害人类健康的恶性肿瘤。本研究通过提取二年残孔菌和虎皮香菇中的胞外多糖，发现其多糖组分均能抑制人体2种肿瘤细胞的生长，为研制新的抗癌活性物质和进一步开发利用二年残孔菌和虎皮香菇提供实验依据。

（1）实验材料不同条件下的两种真菌胞外多糖粗品，Hepg 2细胞和MG63细胞由中国科学院水生生物研究所提供。

（2）实验方法 水杨酸法测定胞外多糖对羟基自由基的清除率

利用H₂O₂与Fe²⁺混合产生·OH，在反应体系中加入水杨酸捕捉·OH产生有色物质，该有色物质的最大吸收波长为510nm。反应体系中包含8.8mmol/L H₂O₂2mL、9mmol/L FeSO₄2mL、9mmol/L水杨酸－乙醇溶液2mL，不同浓度（2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L）的多糖样品各2mL，最后加入H₂O₂启动反应，在37℃下反应30min，以蒸馏水为对照，在510nm下测定不同浓度下的吸光度。考虑到多糖样品本身的吸光值，同时以蒸馏水代替H₂O₂进行测定作为多糖的本底吸收值。按下式计算·OH清除率：

其中，A₀为空白对照液的吸光度；Ax为加入样品后的吸光度；Ax₀为不加显色剂H₂O₂的多糖溶液本底的吸光度。

①测定胞外多糖对·DPPH的清除率：2mL多糖溶液及2mL浓度为0.1g/L的·DPPH 50%乙醇溶液先后加入同一试管中，摇匀，25℃放置30min，以50%乙醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度Ai。

2mL浓度为0.1g/L的·DPPH 50%乙醇溶液及2mL蒸馏水混合，摇匀，25℃放置30min，以50%乙醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度A₀。

2mL多糖溶液及2mL 50%乙醇溶液混合，摇匀，25℃放置30min，以50%乙醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度A_j。A_j的引入是为了去除多糖溶液本身颜色对测定的干扰。

根据下列公式计算胞外粗多糖对DP P H的清除率：

·DPPH清除率＝［1－（A_i－A_j）/A₀］×100%

②MTT法测定胞外多糖的抗肿瘤活性：常规步骤消化Hepg 2（肝癌细胞）细胞和MG63细胞（人成骨肉瘤细胞），细胞计数为7×10⁴个/mL，调整细胞浓度3.5×10⁴个/mL，在96孔板加入细胞100μL/孔（约5×10³），置37℃5% CO₂细胞培养箱培养16h。未加细胞孔加入200μLPBS。加入适当浓度的所检测的化合物；每个浓度做5个复孔。将96孔板在含5% CO₂空气、100%相对湿度和温度为37℃的细胞培养箱中，分别孵育24h、48h、72h。每孔加入10μL CCK－8染色液，在37℃孵育3h。酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。本底OD值为在完全培养基中添加MTT，不添加细胞。

（3）二年残孔菌不同处理胞外多糖的抗氧化活性 羟基自由基是一种最活跃的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。如图2.16所示，多糖对羟基自由基和DP P H自由基均有一定的清除能力，清除效果与多糖的浓度关系在一定的浓度范围内呈正相关，随着多糖样品质量浓度的增加，对羟基自由基和DP P H自由基的清除能力增强。二年残孔菌经丙酮和吐温80后，抗氧化能力均有提高。多糖浓度为10g/L时，二年残孔菌经丙酮处理后，羟基自由基清除率达到63.23%，DP P H自由基清除率达到44.26%，较未经处理的二年残孔菌多糖均有提高。说明二年残孔菌经丙酮和吐温80处理后，均提高了其抗氧化能力。

（4）二年残孔菌不同处理胞外多糖的抗肿瘤能力 二年残孔菌胞外多糖在体外具有较好的抗肿瘤能力，并在一定范围内呈量效关系。Hepg 2细胞培养72h后，二年残孔菌经吐温80处理多糖浓度达到400μg/mL时，对Hepg 2细胞的抑制率与空白相比呈极显著关系（P＜0.01），最大抑制率达33.45%，比空白（13.05%）提高156%（图2.17）。

MG63细胞培养48h后，吐温80和丙酮处理的二年残孔菌胞外多糖浓度达100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL时，其对细胞的抑制率与对照相比呈显著关系（P＜0.05），随着培养时间和多糖浓度的增加，抑制率呈上升趋势，经丙酮处理后的多糖浓度达到400μg/mL时，与对照相比呈显著关系（P＜0.05），最大抑制率为20.95%，比对照组（12.12%）提高72.85%（图2.18）。

（5）小结 真菌多糖是中药的一种活性成分，是机体的能量物质，存在于所有的细胞膜中，参与细胞的多种生理活动。目前，人们越来越关注真菌多糖的生物活性，特别是抗氧化和抗肿瘤作用。吐温80和丙酮处理后的二年残孔菌和虎皮香菇胞外多糖的抗氧化活性和抗肿瘤能力均有所提高，这与林贵兰等人的研究结果基本一致，为进一步开发抗氧化剂提供理论依据。多糖浓度为10g/L时，丙酮处理后的EPS羟基自由基清除率达到63.23%，DPPH自由基清除率达到44.26%；多糖浓度为400μg/mL时，吐温80处理的EPS对Hepg 2细胞的抑制率与对照相比呈极显著关系（P＜0.01），最大抑制率达33.45%，比对照组提高了156%，丙酮处理的EPS对MG63细胞的抑制率与对照相比呈显著关系（P＜0.05），最大抑制率为20.95%，比对照组提高72.85%。经丙酮和吐温80处理后，虎皮香菇的EPS抗氧化和抗肿瘤活性也有了显著提高，当多糖浓度为10g/L时丙酮处理的EPS羟基自由基清除率为29.26%；当多糖浓度为8g/L时，丙酮处理的EPS DPPH自由基的清除率达到63.08%，比对照组提高将近2倍。丙酮处理的EPS浓度达到400μg/mL时，与对照组相比显著（P＜0.01），对Hepg 2细胞的抑制率达到22.85%比对照组提高134%，丙酮处理EPS对MG63细胞的抑制率达到25.29%，比对照组提高135%。

本工作选用常规的测定方法测定两种真菌的抗氧化活性和抗肿瘤活性，添加吐温80和丙酮后两种真菌胞外多糖的抗氧化活性和抗肿瘤能力均有明显提高，具有重要的开发应用价值，其作用机理仍需进一步研究。