学习活动4 外植体的污染与防止

【学习目标】 1．能认识外植体的真菌、细菌等污染类型。

2．能正确分析外植体污染的原因。

3．能提出防止外植体污染的措施。

【学习准备】 被真菌、细菌污染的外植体。

【学习过程】

问题

外植体接种后污染的培养基有哪些特征？为什么会产生污染？

基本知识

一、污染现象

污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

二、污染产生的原因及防止措施

污染分为细菌污染和真菌污染两种情况。

（一）细菌污染的症状及引起的原因

培养材料及培养基上出现黏液状物体或浑浊的水迹状痕或发酵状泡沫，或在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹，即细菌污染现象。细菌污染一般在接种后1~2d可发现。除了材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，接种人员操作不慎也是造成细菌污染的重要原因，主要由工具灭菌不彻底以及呼吸时呼出的细菌所引起。手接触培养材料或器皿表面也会引起污染。因此，要求工作人员严格按照无菌操作程序操作。

（二）真菌污染的症状及引起的原因

培养基和培养物上长霉，即真菌污染现象。接种后3~5d就可发现。霉的颜色有黑、黄、白等。真菌污染多由环境不清洁和空气污染造成，如接种室的环境不洁净，灰尘很多；超净工作台的过滤装置失效；培养用的容器口过大；操作不慎等。

虽然组织培养技术操作并不难，但对一些技术环节的要求十分严格，稍有疏忽便会延误实验进程，甚至导致整个实验失败，为此必须重视组织培养生产过程中污染带来的危害。

图4-4-1培养材料的真菌污染

（三）组织培养生产过程中污染的来源

1．外植体自身带菌

许多植物都栽培在室外，而空气中有大量微生物存在，这些微生物可通过植物自然的孔口或伤口进入植物内部，也有一些兼性腐生菌，可由外植体或通过相应的侵入机制侵入植株内部，如果在接种操作前对这些认识不足，对外植体消毒不严，就很容易发生污染现象。

2．培养基或接种工具灭菌不彻底

培养基灭菌过程中，灭菌时间过短、灭菌时温度达不到要求、灭菌锅压力记数不准等因素都有可能导致培养基灭菌不彻底，使一些病原微生物残留在培养基中，从而造成污染。使用灭菌不彻底的接种工具、灭过菌的接种工具存放时间过长，也会在生产中造成污染，所以要做好培养基和接种工具的灭菌工作。

3．接种室消毒不严

在组织培养生产过程中，除了植物本身外，大部分污染来自接种室。因为在接种室中，未过滤的空气中含有大量的微生物，这些微生物可随着操作人员或植株接触而发生污染，所以接种室消毒不严也易引发污染。

4．人员因素

在整个操作室内，人员是最大的带菌者，不管是毛发还是衣服等，都隐藏着数不清的微生物。这些微生物的存在都可能造成一定的危害。为此，在进入操作室前，接种人员的工作服、鞋帽必须进行消毒处理，进入接种室必须换上消毒过的鞋帽；接种前，接种人员必须认真洗手，还要用70%酒精棉球擦拭双手，这样可在一定程度上减轻污染的危害。

5．超净工作台上的滤网过滤不彻底

超净工作台使用过久或保养不当，造成滤网坏掉或灰尘过多，导致在接种操作时对空气过滤不彻底，也易产生污染。

（四）防止污染的方法

1．认真做好外植体的选择和消毒工作

外植体的选择要考虑选择的时间和部位，尽量选取带菌少的材料。一般植株生长旺盛的季节（如春季和夏季），病原微生物数量相对少些，幼嫩部位病原微生物也相对少些，且组织活力旺盛。另外要做好外植体的消毒灭菌工作，消毒剂和消毒时间要根据外植体的幼嫩程度和部位确定，一般要求既将外植体表面的微生物杀死，又尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。在生产实践中防止外植体污染，也可采用多次灭菌和交替灭菌相结合的办法，最终达到消灭杂菌的目的。

2．改善接种室和培养室的环境条件

与外植体自身带菌所产生的污染相比，操作污染和环境污染是可以避免的。生产中要做好接种室与培养室消毒工作，定期熏蒸灭菌，减少环境中的微生物数量，减轻污染的危害。为此，接种前要认真做好接种室消毒工作，超净工作台在接种前要认真擦洗，紫外线灯要开20~30 min。培养室的相对湿度应控制在70%左右。放到超净工作台上的每件物品都要先用75%酒精认真擦洗一遍，只有这样才能在一定程度上控制污染程度。

3．操作人员严格遵守无菌操作规程

接种人员在接种操作中应严格遵守无菌操作规程。接种人员的工作服、口罩、帽子等布质品要定期进行湿热灭菌。在超净工作台的操作区内不要放置过多的备用物品，避免气流被挡住而产生污染。定期清洗或更换超净工作台过滤器。接种前15~20 min打开风机，风速调整到20~30 m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒。工作人员进入操作室前必须对工作服、鞋帽进行消毒处理，进入接种室必须换上消毒过的鞋帽。接种前，接种人员必须认真洗手，还要用70%酒精棉球擦拭双手。只有接种过程中严格遵守操作规程，才可避免人为因素造成的污染。

4．培养基及接种工具要严格灭菌，确保灭菌质量

在对培养基和接种工具灭菌时，要先检查灭菌锅的使用情况，发现问题立即检修。灭菌过程中要保证灭菌应达到的压力、时间，确保灭菌质量。培养基一般要求在汽相121℃条件下灭菌20~25 min。压力表降到零后不能马上出锅，防止外界冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染，应待锅内稍冷却后再出锅。培养容器封口使用的塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等材料，在使用前要认真做好清洗和消毒工作，不符合要求坚决不用。在分装培养基时，勿触瓶口，防止培养基黏在瓶口上，引起污染；瓶口封好后要检查封口是否破损，瓶口绑扎位置是否适当，松紧是否适宜。已污染的组织培养瓶要经高压灭菌后再清洗，防止污染源扩散。

5．在培养基中加入适量的抗生素

这是目前较常用的方法，抗生素可以直接加到培养基中，也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。植物种类不同，所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同。一般情况下，为消除革兰氏阳性菌对某些木本植物茎段组培苗的污染，可在培养基中加入四环素、头孢等混合物。另外，用头孢菌素Ⅱ消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

6．利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物生长

培养基中适当增大盐或糖的浓度可抑制微生物生长，单宁酸存在时也可以达到抑制微生物生长的效果。

7．减少培养基中某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖

培养基中有机物如维生素B1、维生素B6、烟酸等有机成分，是某些细菌生长的必需物质，去除这些有机物后，细菌无法生长繁殖，逐渐死亡。这样也可在一定程度上减轻污染所带来的危害。

总之，组织培养中污染很容易发生，只有思想上高度重视，行动上严格遵守操作规范，才能在一定程度上减轻污染所带来的危害。