学习任务4外植体培养

【学习目标】 1．掌握外植体选择的原则。

2．能正确选择外植体。

3．能正确清洗外植体。

4．能正确进行外植体表面灭菌及接种。

5．能针对外植体培养过程中的污染现象采取相应的防治措施。

6．能防止外植体培养过程中的褐变及玻璃化现象。

【工作情境】 一园林公司从外地引进优良的园林绿化树种北海道黄杨，该公司得知我校有植物组织培养实训室，与我校联系共同开发该树种的组培育苗技术。我们认为这是一个很好的校企合作机会，同意合作，并着手技术研发。该项工作从外植体的选择开始，建立无菌培养物，诱导芽增殖，进行继代培养，诱导生根，移栽成活，并建立快繁技术体系。

【工作流程】

图4-1外植体培养工作流程图

学习活动1 外植体的选择、清洗与消毒

【学习目标】 1．掌握外植体选择的原则。

2．能正确清洗外植体。

3．能正确对外植体进行消毒。

【学习准备】 北海道黄杨苗木、洗衣粉、0.1%氯化汞、75%酒精、自来水、毛刷、瓷缸。

【学习过程】

问题1

你了解北海道黄杨这一绿化树种吗？见到过有关其植物组织培养的研究报道吗？

获取信息

北海道黄杨为大叶黄杨的栽培品种，是卫矛科卫矛属的长绿阔叶树种，原产于日本北海道札幌市，树枝挺拔，可修剪整形。在城市公园中可孤植、列植，也可群植。能耐-23.9℃低温，对干旱和盐碱的忍受能力比普通黄杨强。其主要特点为：顶端优势明显，表现出优良苗木特性。长势较快，年生长量最高可达170 cm，平均年生长量70 cm,5年生苗可达3m以上。入冬后成熟的果实开裂，露出红色假种皮，镶嵌在绿叶丛中，观赏价值极高，被誉为“申奥树”，特别适合在北方冬季寒冷、干旱的地区种植。其根、皮、果可入药，治疗烫伤极佳。

北海道黄杨的繁殖方法主要有扦插、组织培养、嫁接等。用扦插、嫁接方法繁殖，年增殖率低，还会破坏已长成之植株。组织培养一年四季均可进行，而且繁殖速度最快，苗木壮实，几乎不携带病虫害。因此，建立北海道黄杨的组织培养快繁技术体系，对该树种在本地区的推广具有重要作用。

现提供北海道黄杨组织培养的研究资料。

一、初代培养

1．外植体的选择

选择健壮、品质优良的北海道黄杨新品种，盆栽经室内培养一段时间后，选用带有饱满而未萌发侧芽的当年生嫩茎做外植体，经清洗、表面灭菌后，接种于培养基上。试验发现，枝条中部的侧芽萌发最快，产生芽丛数量较多且苗壮，生长速度快。

2．培养基选择及外植体培养

北海道黄杨整个培养过程都选用MS基本培养基，再加入适量的生长调节物质。外植体培养所加的植物激素，一般只需细胞分裂素（6-BA）一种即可。将外植体接种在适宜的培养基上，控制培养室的温度为（25±3）℃，光照强度为1000~1600 lx，光照时间为12~15 h/d。20 d后芽开始萌发，40 d可形成芽丛2~3个，60 d苗高2~3.5 cm。不同浓度的6-BA对北海道黄杨外植体的作用效果见表4-1-1。

表4-1-1不同浓度的6-BA对北海道黄杨外植体的作用效果

从表4-1-1可知，6-BA的浓度对外植体的萌发有明显的影响，在无6-BA的培养基上，北海道黄杨外植体不萌发，随着6-BA浓度的增高，芽丛数量及苗高逐渐增加，但超过一定量又表现为下降趋势，因此，适合北海道黄杨外植体的培养基配方为：MS+6-BA 0.5~0.8 mg/L。

二、继代培养（茎芽增殖）

将初代培养所获得的无菌苗从原茎段上切下来，切成1.5 cm长的小段，转接到MS+细胞分裂素+生长素的培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽，原茎段弃去。经50 d左右第一代继代培养可获得4~6株具有嫩梢的试管苗（每瓶），以后每隔6~7周转接继代一次，可使无菌试管苗迅速、健壮增殖，数量不断扩大。茎芽增殖过程中，培养基中要加入适量的细胞分裂素（6-BA），以促进侧芽形成，同时加入少量的生长素类药剂（IAA、NAA），以促进幼苗健壮生长。培养室条件同初代培养。不同浓度的6-BA、NAA对北海道黄杨试管苗的茎芽增殖分化及苗的健壮生长作用效果见表4-1-2、表4-1-3。

表4-1-2以MS+NAA 0.05 mg/L为基础，不同浓度的6-BA对北海道黄杨的作用效果

表4-1-3以MS+6-BA 1.0 mg/L为基础，不同浓度的NAA对北海道黄杨的作用效果

由表4-1-2、表4-1-3可知，6-BA对北海道黄杨茎芽增殖有明显影响，NAA在一定范围内对增殖的影响不显著，但随着NAA浓度的增高，愈伤组织产生数量逐渐增多，同时NAA浓度过高会对嫩芽的增殖和伸长产生抑制作用。因此，北海道黄杨茎芽增殖阶段培养基配方以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L效果较好。

三、生根培养

通过继代培养获得的试管苗一般为无根苗，因为在茎芽增殖阶段要控制根的产生，以减少对养分的消耗。当无根苗的数量达到试验预期数量时，即可进行生根培养。生根培养基选用1/2 MS或1/4 MS培养基，植物激素一般只加入生长素（IBA、NAA），培养基中再加300 mg/L活性炭，效果更好。选取2~3 cm高的健壮小苗接种于生根培养基上，培养室的温度控制在28℃~30℃，光照强度增加至1600~2000 lx，光照时间延长至16 h/d,15 d即可产生根原基，20 d左右可长成1~2 mm的白色正常根系，根系较发达，每株苗均在2~6根。不同浓度的生长素对北海道黄杨生根的作用效果见表4-1-4。

表4-1-4以1/2 MS为基础，不同浓度的生长素对北海道黄杨生根的作用效果

由表4- 1- 4可知，北海道黄杨生根培养基以1/2 MS+IBA 0.5 mg/L或1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L效果较好。

四、移栽管理

试管苗合适的移栽时间是根原基突起或长出1~2 mm的短根时，此时移栽既容易清洗，又不伤根，移栽成活率较高。

1．移栽基质：组培苗的移栽基质应疏松透气，有一定的保水、保肥能力，而且容易进行灭菌处理。选用北海道黄杨移栽基质时，营养杯底部装营养基质（田园土∶粗沙=1∶1），上部2~3 cm装珍珠岩。

2．移栽技术：将已生根的试管苗放在温室中炼苗3~5d，然后移栽。移栽时，取出的试管苗首先用0.1%多菌灵溶液轻轻洗掉根部的培养基，然后种入经过消毒灭菌的基质中。

移栽后最初几天要求保持高湿（相对湿度90%~100%），可以在大棚内设小拱棚，每天喷雾3~4次，并且注意通风和防治病菌，可用0.1%多菌灵溶液定期（每周1~2次）喷洒。当试管苗适应了新的环境后，再逐渐降低空气湿度，最终过渡到可在正常的温室或自然条件下生长。

移栽过程中应避免强烈的直射光，以较高强度的散射光为好，经过一段时间后，再逐渐增加光照强度。温室温度控制在18℃~20℃为宜。1个月后，进行第二次移栽，实行正常管理。移栽成活率可达到85%以上。

基本知识

一、外植体的选择

外植体是指植物组织培养中第一次接种用的各种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等。

从理论上讲，植物细胞具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。

1．选择优良的种质及母株

无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才能转化成商品；生长健壮、无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。

北海道黄杨是优良绿化树种，特别适合在北方冬季寒冷、干旱的地区栽植，因此，建立北海道黄杨的组织培养快繁技术体系，对该树种在本地区的推广具有重要作用。

2．选择适当的时期

组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段。对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料微生物侵染比较少，同时内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、叶片，在不加生长素的培养基中可自由地生长、分化，其他季节则不能。叶子花的腋芽培养，如果在11月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；在3~8月间采集，则萌发数目多，萌发速度快。对多数一年生的花卉植物来说，虽然无明显的生长期和休眠期，但仍以幼嫩的组织和器官为好。北海道黄杨选择健壮的植株，经室内盆栽培养一段时间后，形成当年生嫩茎，此时进行组织培养最适宜。

3．选取适宜的大小

培养材料的大小根据植物种类、器官和培养目的来确定。通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为20~25 mm2，其他培养材料的长度为0.5~1 cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。茎尖分生组织带1~2个叶原基，长度为0.2~0.3 mm。材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。

二、外植体的取材部位

植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。

木本植物、较大的草本植物一般选取茎段比较适宜，其能在培养基中萌发侧芽，进一步发育出繁殖材料，如月季、黄杨、变叶木等。一些草本植物本身矮小，或缺乏显著的茎，一般可选用叶片、叶柄、花葶或花瓣等做外植体，如非洲菊、紫罗兰、康乃馨、秋海棠、菊花等。北海道黄杨选用带有饱满而未萌发侧芽的当年生嫩茎做外植体，取得了良好效果。

图4-1-1月季外植体培养

1．茎尖

茎尖不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径，因此茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。

2．节间部

大部分果树和花卉等植物，新梢的节间部是组织培养较好的材料。新梢节间部不仅消毒容易，而且脱分化和再分化能力较强，因此是常用的组织培养材料。

3．叶片和叶柄

叶片和叶柄取材容易，新出的叶片杂菌较少，实验操作方便，是植物组织培养中常用的材料，尤其是近年在植物的遗传转化中，以叶片为试验材料的报道很多。

4．鳞片

水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。

5．其他

种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。

但是，不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。如百合科植物风信子、虎眼万年青等比较容易形成再生小植株，而郁金香就比较困难。百合鳞茎的鳞片外层比内层再生能力强，下段比中、上段再生能力强。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为外植体。

三、外植体的消毒

植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因为植物组织培养是在无菌条件下进行的，所以无菌的外植体是取得组织培养成功的基本保证。接种培养前必须对材料进行消毒处理，消毒要求既把材料表面的各种微生物杀灭，又不能损伤或只轻微损伤材料而不影响其生长。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要环节。

1．外植体的冲洗、刷洗

植株在生长过程中会受到土壤、肥料中杂菌的污染，所以采回并修剪好的外植体应首先用自来水冲洗，然后用浓洗衣粉水浸泡，用软毛刷轻轻刷洗后，再用清水冲洗干净。

2．常用的消毒剂及其效果比较

不同的外植体，不同年龄以及不同季节选取的外植体，消毒方法也不相同。首先是消毒剂的种类、浓度不同，其次是消毒的时间不同，最终是消毒效果也不同。

常用的消毒剂如表4-1-5所示。理想的消毒剂应消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。

表4-1-5常用消毒剂的使用方法及效果

（1）酒精：酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。

酒精具有较强的穿透力，可使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，有利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。

（2）升汞：又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。

（3）次氯酸钠：次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。

（4）漂白粉：漂白粉的有效成分是次氯酸钙［Ca（ClO）2］，消毒效果很好，对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。

（5）过氧化氢：也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。

（6）新洁尔灭：这是一种广谱表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。

3．外植体的消毒方法

（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒：消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。

消毒工作在超净工作台上进行，先用70%酒精浸泡10~30 s，以无菌水冲洗2~3次，然后按材料的老嫩和枝条的坚实程度，分别用2%次氯酸钠浸泡10~15 min或用0.1%升汞浸泡5~10 min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分接触。若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗3~5次。

（2）果实及种子的消毒：先用自来水冲洗10~20 min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸泡10 min，后用无菌水冲洗2~3次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30 min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10 min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8~10 min。

（3）花药的消毒：用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10 min，最后用无菌水冲洗2~3次。

（4）根及地下部器官的消毒：由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸泡5~10 min或2%次氯酸钠中浸泡10~15 min，最后用无菌水冲洗3次。

在操作时要根据材料的大小、老嫩、质地等差异作出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应是最大限度杀死材料上的微生物而又对材料的损伤最小。

问题2

外植体消毒灭菌是外植体培养成功与否的关键，那么外植体消毒灭菌工作应遵循怎样的操作流程呢？

基本操作

四、外植体消毒灭菌的操作流程

图4-1-2外植体消毒灭菌的操作流程