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第十节 淋巴管内皮细胞培养法
近年来,人们采用组织细胞的培养技术研究淋巴管内皮细胞的生物学特性和生理功能。1984年,Johnson首先成功地分离、培养了牛肠系膜淋巴管内皮细胞,并观察了其形态学特征。此后,有关淋巴管内皮细胞的体外培养技术逐步完善,并得到广泛应用。在国内相关研究虽然起步较晚,但也取得一些进展。
研究多是选用大动物的淋巴管(如牛、猪和狗的胸导管),在胸导管内皮细胞上进行黏附分子表达、淋巴管内皮细胞迁移、增殖和新生淋巴管等实验。2003年,李益民等采用大鼠的胸导管进行体外培养,研究其生物学特性,为进一步研究与淋巴管内皮细胞相关的大鼠动物模型及获得相应剂盒检测提供了资料。2004年,刘晔等则成功对大鼠肠系膜淋巴管内皮细胞进行了分离和培养,克服了胸导管等粗大淋巴管内皮细胞生长缓慢、有明显惰性的缺点;张常华等(2009)对胃癌大鼠皮下移植瘤的淋巴管内皮细胞进行了分离培养与鉴定,为进一步研究淋巴管生成在肿瘤转移扩散中的作用奠定了基础;2010年,王玲等利用现代生物学手段获得了人皮肤中数量、分离效率和纯度均较高的毛细淋巴管内皮细胞,为今后人淋巴管内皮细胞生物学特性的研究提供了材料。
淋巴管内皮细胞的分离纯化是淋巴管内皮细胞培养技术的一个关键。有人将含有染料的磷酸缓冲液PBS注入牛的肠系膜淋巴结来标记淋巴管,然后用胶原酶灌注肠系膜淋巴管获取淋巴管内皮细胞,但此法对于大鼠等小型动物不适用。Leak(1993)等用胶原酶、胰岛素-乙二胺四乙酸EDTA处理牛肠系膜淋巴管获得内皮细胞进行培养。有人不赞同EDTA与胶原酶合用,因为EDTA虽可除去在细胞粘连中起关键作用的Ca 2+,但胶原酶活性是依赖Ca 2+的。Djoneidi等(1991)用大鼠胸导管采用帖块法培养胸导管内皮细胞,此法未去除胸导管外膜,未将组织剪碎,这将影响内皮细胞贴壁的速度和数量;李益民等(2003)通过喂食大鼠脂肪,使胸导管充盈呈乳白色易于辨认,尽量取胸导管全长,在体视显微镜下尽量去除胸导管外膜及周围结缔组织,不使用胶原酶,组织块应尽量剪碎,以便使内皮细胞容易贴壁,内皮细胞移入培养瓶后应在一定时间内保持完全静止,观察时动作要轻微,并及时换液。
刘晔等(2004)用植块培养法获得了大鼠肠系膜淋巴管内皮细胞,认为这种方法较酶消化法更为简便、经济,无需使用昂贵的胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶,也不经组织剪碎、匀浆、过滤等复杂而易损伤细胞的程序;许天文(2006)则利用酶消化法成功地分离了大鼠胸导管内皮细胞,但其改进了培养条件,应用了EGM2培养基和低氧条件(5% O 2、5% CO 2和90% N 2),使其获得了稳定传代的纯正淋巴管内皮细胞。缺氧条件的选择与国外学者发现的淋巴管内皮细胞在低氧分压水平下发挥生理功能的研究结果相吻合;张常华等(2009)采用显微淋巴管解剖和免疫磁珠分选纯化法成功分选了移植瘤的淋巴管内皮细胞。王玲等(2010)联合应用酶消化、抗体免疫微珠和细胞克隆柱纯化的方法获得了人皮肤毛细淋巴管内皮细胞。
淋巴管内皮细胞培养成功,将对今后揭示淋巴管内皮细胞的来源和淋巴管的发生,对探讨肿瘤淋巴道转移时肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞之间的作用机制等方面打下良好的基础。
(王云祥)