肿瘤蛋白标志物是肿瘤细胞或肿瘤细胞与机体相互作用产生的反映肿瘤存在和生物学特性的蛋白质。肿瘤发生发展的内在原因是遗传物质的改变，而蛋白编码基因的改变必然会导致蛋白质表达数量和质量的改变，这些异常改变的蛋白质是肿瘤蛋白标志物的主要来源。此外，致癌因素或肿瘤细胞与机体的相互作用，也可以促进一些肿瘤蛋白标志物的产生，如EB病毒诱导免疫系统产生的抗VCA-IgA等抗体，可作为鼻咽癌发病高危人群的重要筛查标志物。

肿瘤蛋白标志物既可以是分泌蛋白存在于体液中，也可以是组织蛋白存在于肿瘤组织中。由于血液样本取材便利，检测手段丰富，自动化程度较高，而且便于动态取材，血液中肿瘤蛋白标志物的检测可贯穿于高危人群筛查、辅助诊断、病情和疗效监测的全过程，是最早应用于肿瘤辅助诊断的肿瘤标志物来源。检测肿瘤组织中的蛋白标志物可在分子水平上对肿瘤进行分类，预测其生物学行为和抗肿瘤治疗的反应性，但是这些检测必须待肿瘤取材后方可进行，对肿瘤诊断和病情监测意义不大，而且受到样本数量和保存技术的限制，其应用亦受到一定限制。目前，肿瘤蛋白标志物的检测技术主要包括以下几类。

液相芯片技术（Luminex xMAP），又称悬浮阵列（MASA）、流式荧光技术，是20世纪90年代后期发展起来的被喻为后基因时代的新芯片技术。它基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪（Luminex 100 ^TM），并有机地整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有高水平的检测特异性和灵敏度，可自动实现核酸、酶、受体、抗体、抗原、小分子有机物等多通道高通量分析。

该技术的核心是把微小的聚苯乙烯颗粒（直径约5. 6μm）亦称微球（bead or microsphere）分别包覆以不同比例的红光及红外光染色剂，制成多达数百种不同颜色的微球，每一种拥有一个编号。每种微球因为内部荧光比例不同而具有特定的光谱特征，可被激光特异的识别。分析过程中，将不同编号的微球共价交联上针对特定目的分子（抗体/抗原或DNA/RNA）的探针分子，检测样品中的目的分子，目的分子再与带有荧光的报告分子结合（图3-1）。检测时，使单个的微球通过检测通道，并使用双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测。红色激光激发的是微球上的红色分类荧光，根据微球的不同色彩编号，可以将微球分类，从而将各个不同的分析反应区分开来。绿色激光激发的是绿色报告荧光分子，目的是确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微珠种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物的浓度。由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，其设计理念亦同样体现了计算机芯片的并行处理和高密度集成、高通量的精髓，所以冠以“液相芯片”之称。

液相芯片技术具有三大核心优势：①高通量，一次操作可以检测数百个指标；②既能检测蛋白，又能检测核酸；③既能用于临床，又能用于科研。此外，该技术还具有需样本量少（检测需样本量仅为10μl）、高速度（最快可达10 000测试/h）、灵敏度高（检测低限为10pg/ml）、线性范围广（检测范围可达6个数量级）、重复性好、成本低、操作方便、数字信号、客观可靠等优点。

液相芯片的主要缺点是检测血清中的特异性抗体时，检测的背景信号过高，对实验造成干扰。其产生的原因是血清中含有的某些抗体可以直接非特异性地结合在微球表面，而这种非特异性的结合与微球呈现的抗原性无关，因此不能被系统所识别。

液相芯片技术在肿瘤标志物检测中的应用主要是免疫分析，其反应原理与ELISA法相似。表面带有羧基的聚苯乙烯微球，在碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化后可以同蛋白分子的氨基形成共价键，由此可以包被蛋白探针，检测样本中的目的分子。此外，液相芯片技术还广泛应用于各种细胞表面抗原、抗体、激素、黏附分子等几乎所有的生物标记物的检测。

免疫标记技术是指用酶、放射性核素、化学（或生物）发光剂等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并借助于酶标仪、射线测量仪、发光免疫测定仪等仪器，对实验结果直接观察或进行检测，从而对抗原抗体反应进行定性、定量研究。

ELISA是酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的简称。ELISA是以免疫反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。ELISA可在微克、甚至纳克水平上对肿瘤标志物进行定量。ELISA检测操作简便，特别是对样本前处理要求简单，易于推广，具有准确、灵敏、快速、特异、经济等特点。

化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA），是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的技术。CLIA主要包括免疫分析和化学发光分析两个系统。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原——抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪进行检测。根据化学发光标记物与发光强度的关系，可利用标准曲线计算出被测物的含量。

放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是一种将放射性核素测量的高灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量物质的技术。经典的放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。将检测限由毫克、微克级提高到纳克、皮克级的水平。由于此项技术具有灵敏性高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少的诸多优势，因此在医学及其他生物学科的研究领域中被广泛应用于各种微量蛋白质、激素及肿瘤标志物等的分析与定量测定。

时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是近年发展起来的无环境污染的高灵敏度免疫标记检测技术，是用镧系元素作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素或生物活性细胞 ^［1］，与其螯合剂和增强液在待反应体系发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，荧光强度与待测物的浓度相关，根据荧光强度和相对荧光强度比值，通过计算机数据处理系统可以给出待测物的浓度，从而达到定量分析的目的。

免疫组织化学又称免疫细胞化学，其原理是依据抗原与抗体结合的特异性，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、核素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

目前常用的免疫组织化学技术有以下几种：

基本原理是把已知的抗原或抗体标记上荧光素，以它作为探针检测组织或细胞内的相应物质。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。

基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位。

由于酶标法中酶与抗体间的共价连接可损害部分抗体和酶的活性，并且抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等缺点，Sternberger等发展了非标记抗体酶法，包括酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method，PAP法）。

1981年Hsu等创立了亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法），该法利用卵白素和生物素的亲和力比抗原和抗体的亲和力高百万倍，又不影响它们间生物活性的特点，使卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和酶，酶催化底物后生成终产物，沉淀于抗原抗体活性部位，使抗原与抗体反应信号放大，增加检测敏感性。

1984年Cordellt Massen等人创立了APAAP法，该法的基本原理是在加入一抗后，依靠二抗的桥作用，将抗原抗体复合物和APAAP复合物连接起来，然后通过复合物中的磷酸酶对底物的水解，生成鲜红色或蓝色［一般底物采用的是偶氮染料快红（fast red），或者快蓝（fast blue）］的产物。该方法敏感性高，不受组织中内源性过氧化物酶的影响和干扰，可产生出鲜艳的红色或蓝色阳性物，非常容易被鉴别，常被用作双标。

1978年Geoghegan等首次应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的IGSS。基本原理是通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用，用对苯二酚将银离子还原成银原子，被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银壳”，“银壳”亦具有催化作用，使更多的银离子还原并促进“银壳”越长越大，最终在光镜下就能看到被放大的黑褐色物质。

90年代初提出了用链霉素化卵白素（streptavidin）替代ABC法中的卵白素生物素复合物。该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物素亲和力极高的结合点。LSAB法是目前国内使用最广泛的一种方法，由于它的敏感性强，效果好，背景清晰，节省时间，无杂质而大受人们的欢迎。

该法是近几年在国内推广使用的一种方法，它的原理是将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，当形成复合物后，可直接与抗原抗体的复合物聚合在一起，经DAB显色即可完成染色。

目前，免疫组化方法在肿瘤病理诊断中主要用于肿瘤标志物识别及各种肿瘤的鉴别，应用相当广泛，如Abiyasi Nanding等应用该技术研究发现，肿瘤抑制基因的表达在胃肠道间质瘤从低风险向高风险的变化上显示了一个下降趋势，有望作为胃肠道间质瘤的预后指标之一 ^［2］。

质谱技术是一种测量离子荷质比的分析方法。其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使之发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，并能准确测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，因此，质谱技术广泛地应用于医药及生命科学等各个领域。

质谱仪种类繁多，不同仪器原理不同。如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。而电喷雾电离质谱（ESI-MS）技术则是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子蛋白物质的目的。此外快原子轰击质谱技术（FABMS）是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。上述各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。

用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：①肽质量指纹图谱（PMF），即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。②串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。③梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。

由于质谱技术在定性分析的同时，还可对待测样品进行定量分析，因此其在现有临床标志物分析中也受到了广泛关注 ^［3］。如Agger等 ^［4］用三氟乙醇使血浆蛋白变性，然后用其酶解产物直接定量分析载脂蛋白A和B，可以获得与目前临床免疫学方法相似的定量效果。针对低丰度蛋白质，质谱技术通过与蛋白质分离策略的结合，可以满足临床检验分析的需要。以PSA为例，Barnidge等利用核素标记PSA的N末端酶解肽段IVGGWECEK掺入无PSA的血清酶解产物，建立了基于质谱技术的PSA绝对定量方法。以此为基础，Kulasingam等 ^［5］和Fortin等 ^［6］结合血清高丰度蛋白去除的方法以及混合阳离子固相分离，用核素标记的酶解肽段IVGGWECEK和LSEPAELTDAVK作定量参照，使PSA分析LOD达到1. 5g/L，LOQ达到2. 2～5. 0g/L。而在缺乏免疫学手段的候选标志物研究中的质谱技术也显示出了研发上投入少、周期短等独特的优势。例如TIMP-1的异常糖基化见于很多肿瘤细胞，异常糖基化的TIMP-1可能与肿瘤的发展密切相关。但是，由于缺乏分析TIMP-1异常糖基化的有效手段，一直不能确定其能否成为肿瘤的标志。Ahn等 ^［7］建立了基于质谱技术的稳定核素标准和用抗肽抗体提取（SISCAPA）技术，可检测到0. 8L的异常糖基化的TIMP-1，为验证异常糖基化的TIMP-1在肿瘤诊断中的作用奠定了基础。Chalmers等 ^［8］收集63例胃癌患者内镜切除标本和43名志愿者组织。采用相同的技术建立了蛋白质谱模型，共筛选出73个差异蛋白，其灵敏度为93. 8%，特异性为95. 5%。此外质谱技术的诸多特性使其获得了高通量“验证”候选标志物，突破蛋白质组学标志物研究的瓶颈，具有巨大的应用潜力。