骨再生( bone regeneration)已经不再是一个陌生的话题，临床上众多科室都有所涉及，例如骨科、神经外科、整形科、口腔颌面外科等。脊柱损伤、骨不连、大面积骨缺失、骨质疏松的治疗都需要骨再生的支持。当前主流的治疗方法是利用人工合成材料替代治疗，这些人工材料生物相容性较差，远期失败率较高。新兴的生物性治疗骨疾病的方法虽然能够部分解决免疫排斥的问题，但是仍然存在许多缺陷，例如自体骨移植( autologous bone grafts)会造成患者其他部位的缺陷，骨诱导形成蛋白不仅需要量大、价格昂贵，而且其疗效因人而异。MSCs具有成骨方向分化的潜能，所以被广大研究者视为骨再生的最佳选择。

想要利用MSCs在体内促进骨再生，往往涉及陶瓷支架( ceramic scaffold)，这是一种由羟基磷灰石( hydroxyapatite)和β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate)组成的生物相容性较好的材料，将MSCs作为种子细胞( seed cells)以单细胞或者细胞膜片( cell sheet)的形式接种在支架上，植入体内修复骨缺损。如果没有生物陶瓷支架的骨向诱导，植入的MSCs会在骨缺损处形成非特异性的结缔组织。许多研究者利用不同种属来源的BMMSCs接种在生物陶瓷上，继而用此修复动物模型的骨缺损，获得了较好的疗效。Bruder等用自体MSCs修复犬股骨的极限缺损，他们发现，缺损处的形成的新骨是植入的自体MSCs来源的。随后他们又利用人MSCs修复裸鼠股骨缺损获得了类似的结果。之后又有学者利用异体MSCs修复犬股骨缺损，不仅没有产生免疫排斥反应，而且修复效果甚佳。科学家们利用大动物进行骨缺损修复的研究，发现绵羊自体MSCs完全可以修复较大的骨缺损。据此，科学家们利用相似的方法再生出大量的骨组织用以帮助相邻椎体的骨融合，这就是我们所熟知的脊柱融合术( spinal fusion)理念。这种融合术可以取代传统的金属螺丝作为连接两脊椎的媒介。这种基于MSCs的骨缺损修复方法已经在兔和恒河猴模型中得到了验证，研究者发现，接种了MSCs的材料成骨能力明显优于没有接种MSCs的材料。鉴于动物实验的经验及充足的实验证据，Quarto等尝试用此种方法修复三个患者长骨上4～7cm的缺损。移植用的MSCs取自患者自体，在体外培养扩增。他们将多孔羟基磷灰石预制成缺损骨块的形状，然后把细胞接种在成形的多孔羟基磷灰石支架上，最后一起植入缺损处。虽然患者在移植后需要经过6～7个月的功能恢复期训练，但是，在随访的6年内没有发生其他相关问题，并且至少在5年之内，生物陶瓷支架没有发生吸收的现象。

有许多研究利用可吸收的生物支架作为载体，植入体内后，不仅可以达到为MSCs提供空间支架的作用，而且能够随着时间的延长而逐渐被机体吸收，有着较好的前景，但是，其长期效果仍有待研究。

此外，国内外的不少文献报道，系统注射MSCs可以有效改善骨质疏松、骨关节炎等疾病的临床症状。这提示，MSCs在进入循环系统后，可能通过迁移归巢或者旁分泌的作用对疾病进行调节。但是具体治疗机制尚不清楚。因此，科学家们试图通过人工干预MSCs某些基因、蛋白的表达，探索MSCs发挥疗效的具体机制。早在1997年，就有学者提出，BMMSCs是源于骨髓的干细胞，并且能够分化为成骨前体细胞和成骨细胞，因此BMMSCs很可能是一个天然的骨再生基因治疗载体。有学者提出假设，工程化的MSCs具有其他细胞不可比拟的再生优点。当这些细胞经过组织工程的手段获得表达成骨相关因子的功能后，不仅可以通过旁分泌作用影响到间充质组织，还可以通过自分泌作用影响自身，从而促进组织工程化MSCs以及内源性MSCs的成骨分化，进而增强骨形成的能力。那么，MSCs的自分泌和旁分泌功能很有可能起到协同促进更大范围的骨形成的作用。学者们通过工程化手段使小鼠的C3H10T1/2 MSCs细胞系高表达BMP-2，发现此种MSCs的促进成骨分化能力较未经工程化处理的CHO细胞系有明显的提升，虽然CHO细胞系也能够表达BMP-2，但是其在促进骨不连修复的疗效上明显弱于工程化后的MSCs。

利用MSCs作为载体发挥基因治疗的效果远远强于比将蛋白或者基因直接作用于体内的疗效。工程化的MSCs可以定植在受损组织内，持续表达有治疗作用的基因，而局部或单次在受损组织中加载基因或蛋白的效果甚微。众所周知，BMP家族具有诱导骨形成的功能，可以修复局部受伤的骨组织。有学者分别用加载了BMP-2基因的MSCs和高剂量无任何载体的BMP-2蛋白治疗小鼠骨不连，发现使用加载了BMP-2基因的MSCs后，新生骨组织的的量明显多于使用BMP-2裸蛋白。此外，工程化的MSCs在体内的基因表达可以受外界给予的相关抑制剂调控，以避免基因治疗的矫枉过正。

MSCs介导的基因治疗的另外一个优点就是，加载基因的MSCs以一种程序化的方式促进骨修复，包括促进缺损边缘周围的新骨形成，持续促进原发灶骨缺损边缘与新生骨的连接等，而无载体的BMP-2蛋白则观察不到上述的持续修复过程。这种现象可以归因于MSCs植入体内后，可以选择性地定植到缺损部位发挥作用。作为干细胞，MSCs可以对局部的因子及发育信号产生应答，模拟发育过程促进损伤组织的愈合。科学家们发现在重症联合免疫缺陷的小鼠头颅处皮下注射人的MSCs后，MSCs可以定植在邻近的颅骨的骨祖细胞层中。人的BMMSCs同样具有与鼠类BMMSCs类似的再生功能。有学者将BMP-2基因转染进入的BMMSCs，发现这些细胞在体内和体外都具有很强的骨向分化能力，并且在裸鼠体内可以有效修复骨不连，而转染了报告基因的BMMSCs却不能发挥上述的治疗效应。利用电转染方法将BMP-2或BMP-9基因转入MSCs后，同样可以增强MSCs的骨向分化能力，促进骨再生。这可以说明，工程化的MSCs确实比未工程化的MSCs具有更强的再生潜能。

迄今为止，对于工程化MSCs介导的骨再生的判断仍局限于影像学或者基因、蛋白水平的检测，这些手段尚无法有效分析再生骨的生物力学特性。Pelled等报道了再生骨超微结构、化学构成及纳米生物力学的相关检测，他们利用原子显微镜、扫描电镜及纳米压痕( nano-indentation)技术对组织工程骨的特性进行分析。有趣的是，组织工程新生骨的超微结构、化学构成与邻近原位骨组织高度相似，其硬度( hardness)和弹性模量( modulus)较低，但是随着时间的推移，新生骨的硬度和弹性模量会逐渐趋近原位骨组织。

以上研究表明MSCs的特性使得其具有基因治疗的不可替代的优势。这种细胞可以充当特异性的载体，携带治疗相关基因，定植到缺损部位发挥组织再生作用。

众所周知，关节软骨的修复和再生能力极其有限，因此软骨损伤后的再生是骨科临床面临的巨大挑战。目前临床上常用的治疗手段只能在短期内缓解病痛，远期失败率较高。前面已经提到，MSCs具有软骨向分化的潜能，所以MSCs被广大研究者视为软骨再生的最佳细胞来源。学者们很早就开始利用软骨细胞移植来修复软骨缺损，但是效果不尽如人意。曾经有学者将软骨细胞加载到聚合载体上，但是，发现聚合载体会诱导软骨细胞发生凋亡，导致治疗失败。之后，许多研究者利用MSCs的软骨向分化潜能研究软骨再生，但是其效果仍存在争议。有学者经过长时间的观察，发现MSCs不能有效促进软骨再生。另有许多学者将MSCs加载到生物降解支架上，应用于绵羊和兔软骨损伤模型中，发现可以再生出类似的软骨组织。有科学家在体外将MSCs加载到多种聚合材料上，发现其有明显的成软骨能力。细胞加载支架的方式已经是软骨再生的常用方法，许多研究者仍在继续探寻何种支架可以更有效地激发MSCs的成软骨潜能，达到更好的软骨再生效果。

目前，MSCs已经广泛应用于软骨再生的研究当中，但是，这些细胞已经发现的基因中，仅有少数与成软骨相关。有研究发现，MSCs转入TGF-β后，在体外可以明显向成软骨方向分化。Hoffmann等最先发现，将转录因子Brachyury转染进MSCs细胞系C3H10T1/2后，细胞可以高表达软骨特征的Ⅱ型胶原，并且MSCs在体内和体外的成软骨能力得到显著增强。不仅如此，MSCs定植在异位组织后可以有效促进软骨再生，这些再生的软骨组织中可以检测到较多具有增殖活性的软骨细胞。这可能是目前为止，为数不多的基因加载MSCs促进软骨再生的研究。

肌腱和韧带组织损伤是最为常见的软组织损伤。肌腱和韧带组织修复与再生并不是一项简单的工作，目前常用的自体移植、异体移植、异种移植或者生物材料修复都不能获得良好的疗效。应用组织工程方法治疗这种软组织损伤的相关研究屡见不鲜。虽然MSCs向肌腱和韧带组织分化的体外实验已经有一些报道，但是与成骨、成软骨及成脂向分化不同，MSCs向肌腱和韧带组织分化过程中不需要添加诸多因子，而是需要在支架材料和细胞的复合体上加载一个外源性的应力或者是在支架材料上加载透明质酸。但是体外诱导形成的肌腱和韧带组织在体内的修复效果却不甚理想。

目前，肌腱和韧带组织的体内修复与再生仍然需要依赖生物降解支架材料。总结大量研究经验，手术离断兔的髌骨韧带造成的缺损模型是目前常用的肌腱和韧带组织再生动物模型。有学者通过比较损伤部位植入自体MSCs与只植入水凝胶、支架或者单纯缝合对肌腱和韧带组织修复的效果，发现前者可以有效提高损伤组织的物理性能。学者们还发现老年动物来源的MSCs仍然可以诱导年轻动物的肌腱和韧带组织修复。但是另有学者提出相反的观点，他们认为，MSCs引导再生出的肌腱和韧带组织与胶原胶诱导出的组织在形态上没有明显的区别。

Hoffmann等利用工程化手段，使MSCs细胞系C3H10T1/2同时表达BMP-2和Smad8信号相关分子，发现工程化的MSCs可以向肌腱样细胞分化，高表达肌腱和韧带相关基因和蛋白。他们将工程化的MSCs直接植入或者加载在胶原海绵后植入在组织缺损处，无论从形态学还是功能学上，均能够有效促进大鼠损伤跟腱的再生。这是对肌腱和韧带组织再生的一个巨大推进。

现代医学认为，细胞能否在异位环境中存活下来是椎间盘( intervertebral disk，IVD)组织再生所面临的巨大挑战。椎间盘是一种相对缺血和缺氧的组织，在兔模型中，离髓核( nucleus pulposus，NP)细胞最近的血管也有5～8mm的距离，因此，椎间盘的主要营养来源于端板( end plates)，髓核细胞也主要是通过无氧代谢( anaerobic metabolism)获取能量。在这种相对缺氧的环境中，无氧代谢产生的乳酸( lactic acid)会大量堆积，从而形成了酸性的微环境。

目前，针对早期椎间盘退变，只需要修复髓核即可。细胞注射治疗可以免去手术的创伤，所以得到越来越多人的青睐。而注射混合了细胞的水凝胶比单纯注射细胞更有优势，水凝胶具有一定的成形、固定和保护细胞的功能，以便细胞更好地发挥作用。此外，有学者将标记了DiI的大鼠MSCs与透明质酸凝胶( hyaluronan gel)混合后，注射入大鼠鼠尾椎间盘。24小时后，他们发现细胞仍保持着良好的生存能力。14天后，细胞的数量有所减少，但是在注射后28天，细胞的存活率又恢复至很高的水平。与单纯注射凝胶相比，注射细胞凝胶的鼠尾椎间盘的高度略高，说明形成了有一定三维结构的类椎间盘组织。另有研究表明，绿色荧光蛋白( green fluorescent protein，GFP)标记的兔自体MSCs与端胶原混合后注入兔腰椎椎间盘髓核，48周后，可以检测到髓核内GFP+细胞的比例大幅上升。不仅如此，一些GFP+细胞表现出了组织特异性分化特点，它们可以表达髓核的标志性基因以及典型的髓核蛋白等。经过磁共振和X线平片检查以及对再生的髓核基因表达和生化检测后，发现的确在一定程度上重建了受损髓核。以上研究体现了活细胞凝胶在椎间盘再生中的应用前景。然而，我们仍需要通过更全面而精确的手段比较和评价再生的髓核与原位髓核的生物力学特征，才能再生出具备生物功能的髓核。

目前为止，利用基因修饰的MSCs再生椎间盘的研究寥寥无几。有学者试图利用两种基因修饰的MSCs再生出类椎间盘组织。从椎间盘的大体构成上来看，它主要由外部的类肌腱组织、内部的类软骨组织构成。所以，生物支架复合细胞具备了椎间盘再生的结构上的条件。前期研究证实，Smad8/BMP-2修饰的MSCs在体内可以形成类肌腱组织，Brachyury修饰的MSCs在体内可以形成类软骨组织。因此，学者们将Smad8/BMP-2修饰的MSCs接种在预成的环形生物支架上，将混合了表达Brachyury的MSCs的纤维蛋白凝胶充填入环形中空部分。他们将该混合了细胞的生物支架材料植入到体内后，发现可形成与原位椎间盘高度相似的组织。这也为临床治疗提供了一定的参考。

应用MSCs修复骨骼系统面临以下几个问题:一是如何确保外源性的MSCs存活，二是让MSCs在异位环境中向需要的方向分化，三是如何做到体内合理的生物分布。为了评价以上三点，在MSCs修复骨骼系统的研究中，非创伤性的影像学检测方法是必不可少的。例如，应用生物发光成像( bioluminescence imaging，BLI)系统可以检测成骨相关基因启动子下游的荧光素酶报告基因，通过其荧光强度，判断相应成骨基因表达的高低。在纵向研究中，有了这种成像系统，我们不再需要牺牲大量的动物，就可以获得不同时间节点的相关结果。不仅如此，生物发光成像系统还能够无创伤、纵向地检测荧光标记的MSCs在体内的存活及分布情况，并且可以准确定量。更难以置信的是，纤维状共聚焦显微镜( fibered confocal microscope)可以在单个细胞水平检测荧光强度，获得高分辨率的图像。

近年来，MSCs的免疫调控能力逐渐受到学者们的重视，许多研究者将其应用于免疫性疾病的治疗当中。Hurler综合征( IH型黏多糖病)和异染性脑白质营养不良( MLD)都是免疫相关疾病，造血干细胞移植是目前常规治疗手段。科学家发现患病机体注射了异源性BMMSCs后，疾病的症状同样可以得到缓解，但是其具体机制尚不清楚。

学者们为了观察骨髓微环境赋予MSCs对于淋巴细胞的免疫调节能力，将MSCs与混合淋巴细胞或者丝裂原刺激后的淋巴细胞共培养，发现淋巴细胞的增殖效应受到明显抑制。他们还在狒狒模型上发现，MSCs可以明显促进移植皮肤的存活。有研究报道，用HLA半匹配的MSCs治疗肠、肝移植后引起的Ⅳ级移植物抗宿主病( GVHD)获得了很好的疗效。学者们又用HLA不匹配的男性胎儿MSCs治疗患有严重骨发育不良的女性胎儿患者，同样获得了显著的疗效。有学者还发现，从注射了MSCs的个体中获得的淋巴细胞在体外不能有效发生增殖效应。

施松涛等在小鼠炎性肠炎模型和系统性硬化症模型中证实，BMMSCs可以通过Fas/FasL途径诱导体内T细胞凋亡，或者诱导体内产生调节性T细胞( Treg)，从而调节患病机体免疫状态。有研究报道，IFN-γ预处理后的小鼠MSCs和人MSCs均可以明显增强对DSS肠炎和TNBS肠炎的疗效。有研究报道，MSCs可以在体内和体外抑制T细胞的活性，并且能够通过抑制机体对自身髓鞘抗原的攻击而治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎( experimental auto-immune encephalomyelitis，EAE)。有研究证实，系统注射MSCs后可以有效减少脱髓鞘反应和淋巴细胞浸润，从而缓解EAE的临床症状。另研究发现，BMMSCs移植对于系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus，SLE)有较好的疗效。有学者应用小鼠BMMSCs治疗胶原诱导的关节炎，获得了理想的效果。另有学者用人MSCs分别治疗大鼠实验性糖尿病和小鼠狼疮性肾炎肾炎，发现异种MSCs同样可以治疗免疫性疾病。

虽然大量研究证实了MSCs在免疫性疾病中至关重要的作用，但是仍有不少学者提出了反对的意见。有研究显示，虽然MSCs可以在体外抑制免疫细胞的活性，但是系统注射后并不能有效缓解GVHD的症状。甚至还有报道异源性MSCs具有免疫原性，进入体内后可能引起一些免疫反应。因此，MSCs在免疫性疾病的应用研究任重而道远。

有学者提出MSCs在体外可以分化为非骨骼系统细胞，囊括了内胚层、中胚层和外胚层来源的多种细胞，例如内皮细胞、脂肪细胞以及肌细胞等。这就为非骨骼系统组织的再生提供了可能。学者们还发现MSCs在体外多种因子诱导下，可以分化为骨骼肌细胞及脂肪细胞。

许多研究者将MSCs应用于心脏、骨骼肌、神经、肝及胰腺组织再生，其中心脏再生是研究的热点。心肌细胞在出生后就立刻停止分裂，并且可以通过适当肥大代偿相应的心肌功能需求。有研究报道，虽然在心肌梗死后，会有少量的心肌细胞分裂，但是并不能改善心肌损伤状态。心脏移植是治疗肥大型和肥厚型心肌病继发的心衰的主要手段，但是严重受限于供者。经过许多学者的前期研究证实，MSCs是作为心肌组织再生一个极具潜力的细胞。学者们利用小鼠BMMSCs在体外成功诱导出心肌细胞。另有科学家将人BMMSCs移植到成年小鼠心脏后，发现移植后的BMMSCs可以分化为心肌细胞。研究发现，上调大鼠MSCs的Akt1基因，可以有效预防梗死心肌的重塑。此外，用单克隆来源的人BMMSCs再生出了心肌细胞和其他三胚层来源的细胞。他们还发现，将人BMMSCs移植入梗死的心肌后，这些细胞可以共表达心肌细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞的标志。不仅如此，移植入心肌组织的BMMSCs可以高表达血管生成因子和抗凋亡因子，并且可以上调宿主内皮细胞和心肌细胞的增殖活性。科学家们提出，MSCs移植之所以可以促进心肌功能，不仅是通过成肌和成血管作用，还通过抗凋亡、促进分裂以及抑制心肌纤维化所获得的综合效果。令人震惊的是，有学者发现MSCs的某一亚群，应用临床可行的方法，可以使其在单个细胞水平上大量增殖，并且向内脏内胚层方向分化。这群细胞被称为多能成体祖细胞( multipotent adult pro-genitor cells，MAPC)。这种细胞亚群可以通过添加某些生长因子选择性地培养出来，并且可以向肢芽内胚层分化。他们还发现MAPCs来源的内皮细胞( endothelial cells，EC)对肿瘤及伤口愈合的成血管有积极作用。自此以后，科学家们对MSCs的内皮方向分化做了更深入的研究，形成了一套较为完整的培养和诱导分化体系。

中枢神经自我修复能力极低，因而认为中枢神经损伤是不可逆的。因此，通过组织工程手段使神经组织再生意义非凡。有研究报道，动物创伤性脑损伤和脑卒中( stroke)后，体内注射MSCs可以明显促进神经元的存活，限制疾病的发展。学者们将MSCs直接移植到挫伤的脊柱内，发现其能够有效促进机体神经的功能恢复。另有学者发现MSCs可以通过促进髓鞘修复和神经元传导速率达到缓解局部脊髓脱髓鞘病变的效果。有学者提出，MSCs修复神经损伤的机制在于通过神经向分化作用替代损伤或者病变的神经元。

流行病学调查显示，糖尿病( diabetes mellitus)的发病率与日俱增。胰腺的内分泌部分主要由富含胰岛素β细胞的胰岛( islets)及其他细胞组成。发挥正常功能的胰岛素β细胞不足将会导致1型和2型糖尿病。所以胰岛素β细胞替代治疗被视为最为可行的方案。有研究表明，BMMSCs在体外经过培养环境的诱导，或者经胰腺提取物处理后，可以分化为类胰岛细胞。随后又有研究发现，基因修饰后的MSCs在体外特定的培养条件下，可以有效分化为具有分泌胰岛素功能的细胞。但是，MSCs是否真能分化为胰岛素β细胞，其具体机制如何，目前仍争论不休。

由于原代培养的肝脏细胞生命周期短，并且在体外培养过程中很快就会丧失肝细胞的功能，所以肝实质细胞( parenchymal liver cells)的体外模型建立对研究肝脏再生尤为重要。Schwartz及其同事首次报道，成体骨髓来源的干细胞在体外可以分化为肝细胞样细胞。随后科学家们对MSCs体外诱导分化为肝细胞的培养条件进行了研究。一些学者认为，体外培养时添加成纤维细胞生长因子-4( fibroblast growth factor-4，FGF-4)和肝细胞生长因子( hep-atocyte growth factor，HGF)就可以诱导MSCs向肝实质细胞分化;而另一些学者则认为，需要在条件培养体系中加入新鲜的肝脏细胞共培养才能够成功诱导出肝实质细胞。有研究显示，将HGF诱导分化的MSCs移植到肝脏受损的大鼠体内，可以有效恢复血清白蛋白( serum albumin)水平，并且转氨酶( transaminase)活性和肝纤维化程度也随之降低。虽然目前无法再生出完整的肝脏，但是，以上研究成果给肝脏疾病的治疗带来的新的曙光。

众所周知，牙髓炎和牙周炎是不可逆性疾病，一旦发病，最终的结果就是牙髓坏死以及牙齿松动，脱落。因此牙髓和牙周再生对于口腔健康至关重要。目前，从口腔中分离出的MSCs主要有牙髓干细胞( dental pulp stem cells，DPSCs)、牙周膜干细胞( periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以及脱落乳牙牙髓干细胞( SHED)等，它们具有与BMMSCs相似的生物学特性。有研究表明将人阻生齿来源的PDLSCs和牙乳头干细胞植入小型猪体内，发现能够形成牙根-牙周复合物类似物，部分行使正常功能。有研究报道，应用PDLSCs治疗小型猪的牙周缺损，获得了较好的效果。另有研究报道，DPSCs和SHED在适宜的条件下，均有向牙髓组织分化的潜能，但是要形成功能稳定而全面的牙髓组织，还需要深入研究。