无论iPS细胞通过何种方式产生，一个挥之不去的问题是获得的细胞群体总是异质性的，包含了相当数量的不完全重编程细胞甚至未发生重编程的细胞。消除这些“污染细胞”对于再生医学的应用是十分关键的，尤其是对于某些需要高度特化细胞的组织，比如心脏、神经，更是这样。值得注意的是，学界对于iPS细胞的鉴定方法仍在激烈的讨论中，使用本节中介绍的方法存在一定的局限性。未来寻找一套在全世界范围内行得通的标准，将与干细胞的研究和应用同等重要。

在过去的几年中，一套评估iPS多能性，并且比较它们与ES细胞是否等同的标准已逐渐建立并被广为接受。评价重编程首先要明确iPS细胞的形态学特征。iPS细胞被认为可形成紧凑的集落，具有清晰的边界，组成细胞具有较大的细胞核、较大的核仁和相应匮乏的细胞质。这些细胞集落的特征是在重编程过程中获取的。尽管iPS细胞的这些形态学特征与ES细胞甚为相似，其中只有一部分细胞具有相对较为清晰的分子和功能学特征。为了准确地从不完全重编程的细胞中区分出真实的完全重编程的iPS细胞，研究人员尝试寻找分子水平的表达标志。

完全重编程的iPS细胞表达一系列多能性相关基因产物，并且形成一个调控网络。这些基因产物包括Oct3/4、Sox2和Nanog，它们的表达水平可以达到ES细胞的级别，而在体细胞中并不表达。同时它们也可以通过下调 THY1和上调 SSEA1表达，重新激活端粒酶基因的表达。观测它们的表达情况可以使用报告基因标记的方法。细胞的完全重编程也依赖于表观遗传学的变化，可以通过评估多能性相关基因以及分化相关基因的启动子区域的DNA甲基化程度来衡量。多能性干细胞的一个重要标志是组蛋白修饰二价区域，即组蛋白H3同时存在K4与K27的三甲基化，使相关基因维持在待激活状态，可通过染色质免疫共沉淀法评估。此外，表观遗传的重编程过程包含已沉默的X染色体的再激活，往往发生于重编程后期，也可作为多能性的一个标志。由病毒介导的重编程产生的iPS细胞当内源性多能性相关基因激活时病毒基因会发生沉默，同时发生胚胎抗原 SSEA3、 TRA-1-60、 TRA-1-81、DNA甲基转移酶3β和 REX1的表达。如果iPS细胞获取了全部这些特征，它们将会与ES细胞区别很小。

实际上，重编程在表观遗传学水平的表现是很多变的，整合病毒的基因表达也往往会持续性存在，还有很多其他的已知或是未知的因素会影响iPS细胞的特性。比如，ALP活性染色的阳性已被公认是多能性的标志。然而，这种碱性磷酸酶却并不足以作为真正的iPS细胞标志，因为部分重编程的细胞ALP染色也会出现阳性。由于这样的异质性的存在，在正式下多能性结论之前，需要评估重编程细胞的功能特征。

完全重编程细胞仅仅通过分子特征不能直接定义为iPS细胞系，仍需通过功能鉴定。iPS细胞的功能性评估首先从体外分化开始。iPS细胞可分化为拟胚体(一种松散结合的类似于原肠胚时期胚胎的组织)或是发生两极分化。分化后的组织可以通过三胚层的标志物来做鉴定。多能性评估的体内需求催生了嵌合体的应用，通过将iPS细胞注入胚囊中实现组织发育并形成成体结构。此外，还需要评估这种胚囊嵌合体是否具备生殖传递的能力，观察它们是否可以在后代中产生完全由iPS细胞组成的成体小鼠。后代小鼠应该与注入的初级iPS细胞具有遗传稳定性，并且实现三胚层分化和功能性生殖细胞。

对于小鼠iPS细胞最严格的评估是四倍体互补实验。这一方法是将iPS细胞注射进四倍体的小鼠早期胚胎(这种胚胎没有进一步发育能力，仅提供营养和发育环境)，然后再移植入代孕母鼠体内，观察其是否可以发育为成体小鼠。迄今为止，仅有很少的iPS细胞系通过了这项“金标准”测试，通过的iPS细胞往往具有与ES细胞同等强度的实验结果。这项工作于2009年首先由我国科学家周琪领衔完成，他们的3 株iPS细胞系获得了共计27个活体小鼠，经多种分子生物学技术鉴定，证实该小鼠确实从iPS细胞发育而成，有些小鼠现已发育成熟并繁殖了后代。这也成为我国科学家在这一国际热点研究领域所作出的一项重要贡献。

因人类的胚胎学研究受到严格的伦理学控制，目前人类iPS细胞功能性评估的“金标准”是畸胎瘤形成能力测试。畸胎瘤的病理特征为肿瘤组织可由多胚层组织构成，常含有成熟或未成熟的皮肤、牙齿、骨、软骨、神经、肌肉、脂肪、上皮等组织成分，少数亦可含有胃黏膜、胰、肝、肾、肺、甲状腺及胸腺等组织成分，或表现为未成熟的不易定型和分辨的组织。在这项测试中，人类iPS细胞在免疫缺陷小鼠中行皮下注射或肌内注射，评估它们的体内自发性分化潜能。若这些细胞具备真正的多能性，将会形成良好分化的含有三胚层来源组织的瘤体。尽管对于人类iPS细胞这已是最严格的评估方法，它不能检测iPS细胞能否产生人体全部的细胞类型，也无从检测iPS细胞能否实现生殖传递。

关于iPS细胞的重大问题之一是它们是否与ES细胞间存在差异，以及这些差异是否与功能相关。在iPS细胞发现的最初几年中，学界为它们与ES细胞的相似性所惊叹。直到2009年，科学家才开始陆续发现iPS细胞与ES细胞间存在的差异。迄今已有大量文献报道iPS细胞与ES细胞间存在的微小却有实质意义的差异。

iPS细胞和ES细胞在体外分化实验和畸胎瘤形成实验表现出来的不同分化能力让研究人员首次意识到它们的不同。小鼠的iPS细胞畸胎瘤形成效率低于ES细胞，而人类的iPS细胞向造血系、神经上皮系和神经系细胞的分化倾向小于ES细胞。一些学者认为这些差异性现象意味着iPS细胞内在的分化能力比ES细胞低，而也有研究团队认为是由于表观遗传印记的存在，使得不同来源的iPS细胞特异性分化的能力不同(相关内容见前述)。随着表观遗传印记相关的分子差异陆续被证实，为这种功能性差异提供了可靠的解释。

Stadfeld的研究团队使用的多西环素诱导的重编程系统可以进一步将iPS细胞与ES细胞在分子水平的差异与功能相关联。这样的iPS细胞与ES细胞相比，mRNA和microRNA表达水平并无显著差异，仅仅在第12号染色体与发育相关的 DLK1-DIO3印记基因簇出现异常的沉默。这样的iPS细胞产生嵌合体的能力不足，更不能产生全iPS细胞构成的小鼠。而使用组蛋白去乙酰酶抑制剂将 DLK1-DIO3印记基因簇从异常修饰中恢复后，iPS细胞就可以正常形成嵌合体和全iPS细胞构成的小鼠。这说明iPS细胞与ES细胞仅仅数个基因位点的微小差异就可以使它们的细胞行为表现不同。然而，随着iPS细胞传代次数的增加，差异会逐渐缩小。这提示完全的重编程或许是一个渐进的过程，内源性多能性相关基因的激活也是时间依赖性的。

2009年起，科学家开始报道iPS细胞与ES细胞在遗传水平的差异。最初的研究检测到了百余个差异性的基因表达，约4%的基因出现了至少5倍的表达差异。继而，全基因组学分析检测到并确认了小范围的几个相关的基因与差异相关，尤其是在早期代数的iPS细胞中，而这些基因在ES细胞中作为印记基因而存在。此外，iPS细胞和ES细胞在DNA序列和染色体结构方面也存在差异。研究表明，染色体失常是干细胞体外增殖过程中的一种共同特性，无论对于ES细胞、iPS细胞还是其他多能性干细胞，都表现这种特征，其中人类iPS细胞和ES细胞在第12号和第17号染色体均易于出现结构的增添。然而，iPS细胞在第1号和第9号染色体也易于出现额外的增添，而ES细胞却易于在第3号和第20号染色体出现额外的增添。这说明ES细胞与iPS细胞都具有一定的基因组失稳，但iPS细胞随着传代次数的增加更易于发生染色体异常。也有研究表明，重编程细胞易发DNA点突变的聚集，特别是在癌基因激活相关的通路中，与iPS细胞的成瘤相关。早期人类iPS细胞相比于后期iPS细胞或ES细胞拷贝数变异升高，这提示这种差异将带来选择劣势。Laurent等进一步发现亚染色体结构中拷贝数变异的频率在iPS细胞中远比非多能性细胞要高，同时也发现人类ES细胞与iPS细胞在高发拷贝数变异的基因区域有差异，其中ES细胞的拷贝数很高，而部分iPS细胞出现少量的缺失。重编程过程与抑癌基因的缺失确实有关，而随着iPS细胞培养时间的增长，反而引起原癌基因区域拷贝数的增加。

与iPS细胞表观遗传印记相关的是iPS细胞与ES细胞在表观遗传水平出现的差异，重编程过程中也会发生表观遗传修饰的重塑，其中一部分是重编程过程所必需，另外一部分却是不经意间引入的。iPS细胞部分重编程的原因与多能性基因的去甲基化失败有关。Deng等于2009年应用亚硫酸盐测序法首次报道iPS细胞与ES细胞间存在着DNA甲基化差异。在不同实验室中进行的关于多种人类iPS细胞和ES细胞全基因组范围内DNA甲基化水平的分析结果证实，尽管iPS细胞的DNA甲基化组与ES细胞十分类似，iPS细胞表现出表观遗传印记显著的多样性，以及差异性的iPS细胞特异性分化相关的DNA甲基化。部分研究认为这种差异也是iPS细胞代数依赖性的，而另外的研究认为iPS细胞中存在的这种分化、发育相关甲基化区域可以向子代细胞高频传递，而不受传代次数的影响。这种甲基化区域在iPS细胞中相较ES细胞往往更为独特且高发，提示这些区域的甲基化可能是随机的，并且与重编程相关。总之，iPS细胞和ES细胞在DNA甲基化组水平十分类似，却依然可以检测到一种与分化相关的甲基化差异，同时也可以被认为是iPS细胞在表观遗传学水平的重编程不完全。值得注意的是，这种甲基化差异的出现区域并不恒定，并不能代表iPS细胞与ES细胞之间持续连贯的差异，这也提示这种差异可能反映了我们迄今使用的重编程技术本身的局限性。

尽管很多的研究结果都提示iPS细胞和ES细胞间确存在表观遗传学差异，这个概念向所有iPS细胞系扩展仍有一些局限。目前的研究多基于多个不同实验室、使用不同的重编程方法得来，使用聚类分析方法对于基因表达微阵列进行重新分析显示出转录因子信号和实验室的不同对于iPS细胞有影响。这项发现说明iPS细胞受操作条件和环境因素的影响较大，ES细胞同样如此。特定实验室中产出的细胞很可能只对于特定的环境有效。

迄今依然没有研究表明基因的遗传水平表达特征和表观遗传水平调控特征是否相关。不同病毒载体在iPS细胞系中整合程度的差异也将影响iPS细胞的功能。研究证实，当这些转入的基因再次移除后，iPS细胞间以及iPS细胞与ES细胞之间的差异将降低。此外，大多数的iPS细胞集落源自一个初始的重编程细胞，而ES细胞却往往是非克隆来源的。ES细胞的亚克隆之间也存在着遗传水平和表观遗传水平的差异。

考虑到如此多的相关研究结果，让我们回到一开始的问题: iPS细胞与ES细胞究竟是否等同?答案并不是直接明了的。反之，学界正逐步形成一种共识，那就是iPS细胞与ES细胞并不完全相同但也不能显著区分。或者说，它们的群体范围是互相覆盖的，在彼此群体内部的差异或许比群体之间的差异还要大一些。它们的异质性和每种细胞系之间细胞行为的差异比预想的要复杂得多。这两种多能性干细胞从理论上讲，在功能学上是等同的;但实际上，它们的遗传水平、表观遗传水平和分化能力也都存在着差异。这些差异究竟是不是生物多样性本身的结果，亦或是重编程过程中细胞操作导致的差异还不得而知。iPS细胞与ES细胞可靠的分子区别仍在探索中。

还有一点值得注意，那就是ES细胞本身也具有表观遗传异质性，相应具有不同的分化能力，正像在iPS细胞中发现的一样。这些研究结果使得科学家们不得不从iPS细胞和ES细胞的比较工作中再退一步，开始重新考虑如何正确地定义这两种细胞群体。一些学者已经着手进行相关工作，借助一些全基因组学分析、DNA甲基化组学分析和各向分化的高通量实验进行生物信息学特征的收集。他们认为iPS细胞与iPS细胞间、ES细胞与ES细胞间、iPS细胞与ES细胞间均存在着差异，均不能等同于理想的ES细胞。这些差异警示着研究人员慎重而准确地评估他们使用的iPS细胞和ES细胞，无疑将影响这些细胞在再生医学研究、疾病模拟和治疗中的应用。

由于iPS细胞相比于ES细胞表现出的巨大的应用优势，这些差异并不会抵消iPS细胞的应用潜力。反之，iPS细胞和ES细胞在应用中可以互补。对于单基因遗传疾病，从基因方法入手治疗后的细胞系可以作为理想的参照。对于体细胞突变的疾病，由正常组织产生的人类iPS细胞系可以作为参照。对于多因素疾病，参照iPS细胞系可以来源于正常的多胞胎个体。当以上方法均不适用时，正常的ES细胞就可以用来作参照了。

iPS细胞产生之前，人工制造的细胞与自然存在的细胞之间从未有过如此程度的相似性。这种相似性是非常独特的。然而我们研究的ES细胞在一定程度上也有人造的成分(人类进行了操作干预)，不能认为我们现在使用的ES细胞就是iPS细胞参照的金标准。因此，未来的研究仍然需要聚焦在iPS细胞本身的再生医学应用潜力，与ES细胞的研究同属干细胞研究的分支。随着iPS细胞特性鉴定的发展，在未来或许只需要用一套精简却严格的标准去检测新形成的iPS细胞，就可以确定它们向目标组织分化的潜力。这将对再生医学的发展产生重要的推动作用。