衰老逐渐成为研究的热点，越来越多的人力和物力投入到衰老研究中。干细胞衰老是一个各种应激损伤不断积累的过程。这些应激损伤来自于不同途径，主要包括细胞内源性的损伤和来自干细胞微环境的外源性损伤。近十年来对于衰老发生机制的研究取得了快速的进展，提出了多个衰老理论，但各个理论现在仍存在争论，尚没有一种理论被广泛认可。现有的学说主要集中于以下几点:①基因组的不稳定性;②端粒损耗;③表观遗传改变;④蛋白稳态丧失;⑤营养感受失调;⑥线粒体功能障碍;⑦细胞老化;⑧干细胞耗竭;⑨细胞间通信改变。在衰老过程中，上述的多种因素可能联合或者依次发生，通过一系列复杂过程，最终导致器官功能障碍。

细胞内源性衰老是指由细胞内部的结构破坏及异常所导致的干细胞功能障碍。其中主要是各种大分子(蛋白质、脂类、RNA和DNA)的损伤累积造成了干细胞的功能异常，导致干细胞的衰老和消耗。

线粒体自由基衰老理论早在1965年就提出了，该理论认为衰老过程中线粒体功能不断失调导致ROS产生增加，后者则进一步引起线粒体的损坏和细胞的衰老。已有大量研究结果支持该理论。ROS可以导致DNA、蛋白质和脂质等大分子的结构损坏和功能异常，从而引起氧化损伤的不断累积，最终导致细胞衰老或凋亡。但是近5年来，出人意料的研究结果不断出现，使得研究者们开始重新评判该理论。其中一项有影响的研究是发现ROS增加可能延长酵母及线虫的寿命;同样出人意料的是，通过基因操作使得小鼠线粒体ROS和氧化损伤增多并不会加速衰老;反之，拥有更强抗氧化能力的小鼠寿命也没有延长。此外，多种导致线粒体损伤而不增加ROS的基因操作却能够加速衰老。有学者提出ROS可能是一种激活代偿性稳态平衡的机制。随着衰老过程中细胞应激和损伤的增加，ROS同时被激活以促进细胞存活。但是当ROS超过一定阈值后，就不再起减轻衰老的作用，反而加速衰老进程。

在衰老过程中，骨髓腔内及MSCs内ROS水平均明显上升，并且与骨密度呈负相关，提示ROS在骨衰老中扮演关键作用。大量的研究显示，ROS的增加能够抑制骨形成，而通过采用抗氧化剂等手段抑制ROS，可以有效地降低衰老及雌激素缺乏所导致的骨丢失和骨量下降，说明ROS是导致骨衰老过程中MSCs数量和功能异常的核心因素之一。ROS能够通过多条途径对骨髓间充质干细胞产生多方面的损伤:首先，ROS能够导致MSCs凋亡。过量的ROS能够激活MSCs的内源性凋亡通路，引发细胞凋亡。其次，ROS能够抑制MSCs的成骨分化。其机制之一是激活转录因子FOXO1，使FOXO1入核后与β-catenin结合，抑制Wnt通路对于MSCs成骨分化的促进作用;此外，ROS还能够抑制MSCs的增殖，其机制可能是激活了P53，导致细胞周期受到抑制。

DNA是决定细胞性质和功能的物质基础，同时，研究发现DNA是与衰老最密切相关的细胞靶点之一。因为每个细胞内的基因组均含有大量的DNA，而多种外源性及内源性因素均能引起DNA损伤，这些损伤主要包括点突变、转座、染色质增多或缺失、端粒缩短、病毒和转座子插入造成的基因破坏等。有研究发现每个细胞仅仅由于自发性的脱嘌呤和水解就会发生几千次的突变，而细胞在复制过程中也必然会产生一定程度的突变。DNA的突变会导致多种后果。①细胞恶性转化。抑癌基因(例如 P53、 P21等)的突变失活或者癌基因的突变活化均能导致细胞进入无限增殖的状态，形成肿瘤;②细胞衰老;细胞对于外界信号的反应性及自身各种生物学功能下降，无法发挥正常的功能;③细胞凋亡;当DNA损伤积累到一定程度，细胞会激活自我清除的程序，导致细胞凋亡;④功能障碍;细胞失去其正常功能。

基因组的不稳定性和DNA损伤对干细胞功能的影响很大。随着年龄的增长，干细胞中DNA损伤和基因组的不稳定性的增加限制了干细胞的功能。研究显示，当DNA修复机制存在异常时，细胞及机体的衰老进程将明显加快，导致多种早衰症状的发生，包括早发性的骨质疏松。其中一个典型的例子是， LaminA基因突变将导致哈钦森-吉尔福德综合征( Hutchinson-Gilford progeria syndrome)。该病的患者在少年时期就出现脱发、皱纹、骨质疏松等衰老症状，并往往在30岁前就去世。研究发现， Lamin A突变可以导致骨髓间充质干细胞成骨分化异常，从而造成骨形成缺陷，提示基因组的稳定性对于间充质干细胞维持正常功能至关重要。

端粒位于染色体末端的核蛋白复合物，由许多双链的TTAGG重复序列组成，3’端突出的单链结构与端粒结合蛋白有关。DNA聚合酶不能够完全复制位于其末端的线性DNA，因此端粒会随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短。端粒的这种不断缩短可以靠端粒酶来修复。端粒功能障碍可以导致干细胞的衰老和凋亡。端粒功能障碍与双链DNA断裂情形类似，都能诱导P53的表达。在人和小鼠的培养细胞中端粒功能障碍引发P53的表达，从而引起细胞的衰老和凋亡。也有研究发现端粒异常能够诱导P16INK4a的表达。因此P16INK4a和P53都能被端粒依赖的刺激所诱导。小鼠干细胞P53的缺失能够恢复由于端粒功能障碍所导致的表型改变。特别是，端粒功能障碍的小鼠中敲除P53后可以几乎完全消除发生于肠腺和睾丸中干细胞的凋亡。最近研究发现，P53转录过程中的靶点P21CIP能够潜在的抑制细胞周期，在端粒功能障碍小鼠中P21CIP缺失可以恢复肠道和骨髓中的干细胞增殖障碍表型。对干细胞功能的这种促进作用与端粒功能障碍小鼠的寿命延长有关。上述实验表明，在端粒功能障碍的情况下很可能是通过P21CIP的激活来破坏干细胞的增殖和功能，从而促进衰老的发生。端粒对于骨髓间充质干细胞的功能维持也至关重要。有研究发现，在衰老过程中，MSCs的端粒也随之缩短，其缩短可能与端粒酶功能下降相关。而通过增强端粒酶的活性，可以显著降低MSCs的凋亡，促进其体内的成骨功能。

表观遗传是指在基因组DNA不发生改变的情况下，细胞发生的可遗传的改变。表观遗传在维持细胞分化表型、发挥特定功能方面发挥着重要作用。主要的表观调控包括DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化等。表观修饰主要通过控制基因转录的开启和关闭而发挥类似于“开关”的作用。例如，基因启动子区域的高甲基化将阻止相应基因的转录;特定组蛋白氨基酸位点的乙酰化或甲基化能够影响相应核小体DNA的转录活性。

衰老过程伴随多种表观遗传学改变，包括DNA甲基化和组蛋白甲基化，乙酰基化等。这些变化反过来又会影响基因表达及DNA损伤修复，从而导致细胞衰老。在衰老过程中，细胞基因组的甲基化水平整体上升，特别是在很多细胞关键基因的启动子区域的甲基化水平明显升高，推测可能是导致衰老细胞功能异常的主要原因。有研究表明，组蛋白中H3K27和H3K4的乙酰化和三乙酰化阻止相应基因的转录，而在衰老过程中，部分基因序列核小体中组蛋白的乙酰化水平发生明显改变，导致基因转录异常。干细胞的自我更新及分化也受到表观遗传的调控。研究发现，特定组蛋白的甲基化修饰与MSCs的成骨分化过程密切相关。组蛋白甲基转移酶( Histone Demethylases) KDM4B和KDM6B能够去除H3K9me3和H3K27me3的甲基化修饰，从而提高HOX和DLX基因的表达，促进MSCs的成骨分化。而在衰老过程中，KDM4B和KDM6B的表达均下降，造成MSCs成骨分化异常，说明表观遗传学修饰在骨衰老过程中发挥着重要作用。然而，哪些表观遗传学改变是衰老的结果，哪些是导致细胞衰老的原因尚需要更深入的研究。

骨骼组织由骨骼细胞和钙化的胞外基质构成，Ⅰ型胶原是胞外基质的主要成分，同时骨骼中蕴含着丰富的TGF-β、BMP等细胞因子，在骨吸收时被释放出来。骨骼中间充质干细胞的定向分化是否也受到外部微环境的影响，这个问题的研究将有助于实现干细胞分化的人工调控及骨骼再生修复。研究显示以人骨髓细胞产生的基质微环境，包括胶原、纤连蛋白、含亮氨酸小分子蛋白多糖、层粘蛋白等，能够促进间充质干细胞的大量扩增和干性维持，表明基质微环境对于干细胞行为调控的重要性。已有研究证明通过细胞膜片技术能够创建丰富的基质微环境，并能促进牙周膜来源的间充质干细胞的成骨分化能力。以上研究均表明，微环境对成骨相关干细胞各项生物学性能具有重要的影响。最近有研究证实骨吸收时释放的TGF-β1能招募干细胞到骨吸收部位，发育为成骨细胞参与调节骨代谢。骨吸收降解Ⅰ型胶原的产物CTX是否影响干细胞的生物学特性，终末分化的成骨细胞、软骨细胞分泌的蛋白是否反过来影响干细胞的分化，这些问题目前也正在研究中。此外骨骼是机体最大的钙、磷储存库，骨吸收是释放的局部高钙微环境是否对干细胞的迁徙、分化等生物学特性造成影响还有待考证。

在衰老过程中，干细胞所处的微环境也逐渐发生改变，表现在骨基质成分改变、基质物理性能改变、血液供氧下降、炎性因子水平升高等。这些微环境的改变能对于MSCs的功能具有显著的影响。研究显示，衰老骨髓腔中的IGF-1浓度比年轻个体显示降低，导致MSCs成骨分化下降，引起骨形成降低，骨量下降;衰老伴随的低氧环境会造成骨髓间充质干细胞增殖和分化能力降低，尤其影响其成骨和成脂分化潜能;而微环境中的炎性因子( TNF-α、IL-1、IL-6)等，则能够抑制MSCs的成骨分化，并诱导MSCs凋亡，造成其数量减少和功能的降低。

有学者认为衰老过程是一个主动调控的过程。信号传递是一个细胞接收信号，并按照信号指令行使特定功能的过程。有序正确的信号传递过程是保证细胞行使正确功能及机体稳态平衡的关键。特定的信号通路发挥着不同的作用，其中，有一些信号通路已被发现和衰老密切相关。

现在所知与衰老过程关系最为密切的信号通路是胰岛素样生长因子通路。最有力的支持证据来自于各种基因修饰的动物模型。IGF通路在线虫、酵母、果蝇、啮齿类、人类中都是高度保守的。IGF通路被阻断的酵母和线虫将进入一个特殊的静止时期，从而使得寿命得到极大的延长。同样，在小鼠中阻断IGF通路可以明显的延长小鼠寿命。大量研究发现，能量限制所引起的寿命延长很大程度上是依赖抑制IGF信号通路。

IGF通路对于MSCs也具有重要的调控作用。IGF-1促进MSCs的成骨分化，敲除IGF-1的小鼠表现出骨形成下降，骨量低于正常小鼠，其促进作用可能通过激活mTOR( mammalian target of rapamycin)而实现，当使用雷帕霉素抑制mTOR后，可以抑制IGF-1的促成骨分化作用，导致骨形成下降和骨质疏松。更重要的是，体内IGF-1的浓度随衰老进程而降低，导致MSCs成骨分化异常，而通过补充外源性IGF-1可以改善衰老所致的骨质疏松。但是，以上骨衰老研究结论与IGF信号通路对于全身衰老的作用存在一定的矛盾，仍需要更进一步的深入探讨。

TGF-β超家族分子包括TGF-β、BMP等许多成员，通过结合细胞膜上的Ⅱ型受体招募Ⅰ型受体磷酸化，激活经典的Smad通路进行信号传导。TGF-β促进前成骨细胞的分化，抑制成熟成骨细胞的终末分化，而BMP最重要的功能是促进BMSCs定向分化为成骨细胞并形成骨组织。骨骼中TGF-β和BMP的含量非常丰富，骨吸收时从骨基质中释放的TGF-β1能招募间充质干细胞( BMSCs)至骨吸收部位发育为成骨细胞，从而调控骨重建的平衡。研究发现Smad4突变小鼠出现骨质密度、骨容积、骨形成速率和成骨细胞数量均减低，成骨细胞功能下降;大龄突变小鼠骨密度反而增强，可能与TGF-β1下降、RANKL/OPG轴改变导致的破骨活动降低有关;进一步发现Smurf1结合Runx2启动子元件OSE2从而抑制Smad6的表达，BMP-2处理和Smad1转染能抑制上述结合效应，以致促进Smad6的表达。研究证明FGFR3获得性的突变导致骨量的下降，这与p38的磷酸化水平上调从而导致Erk1/2活性提高有关，而且是通过调控成骨细胞和破骨细胞的活性来实现的。Tanaka等将BMP-2与FGF-2联合使用植入骨缺损位点，发现骨形成效果优于单独使用BMP-2组，说明FGF-2提高了BMP2移植位点的钙化和ALP活性，FGF-2能够提高BMP2的骨诱导活性。使用遗传学方法敲除 FGF23基因的小鼠，即 FGF23-/-，表现出了生化及生态异常的短命现象，例如不孕、早衰等现象。DeLuca等对这种基因缺失的小鼠，外源转入人FGF23，能够延长其生存时间。通过检测转入人FGF23后的小鼠血清发现，其转入基因之前的高磷酸酯酶血症、高钙血症、维生素D过多症得到了有效改善，已达到正常小鼠水平。说明FGF23能够调节体内磷平衡和维生素D代谢。在无内源FGF23的协助下，外源FGF23也能够调控细胞矿物离子代谢，防止多重的异常表型。目前已知FGFs/ FGFR与骨骼的发育、遗传疾病及骨修复再生密切相关，FGFR的多种点突变导致发生囟门早闭综合征。这些研究结果表明BMP、FGF联合调控骨衰老中相关成骨干细胞的增殖、分化等生物学行为。但BMP、FGF在对相关成骨干细胞的调控中具有何种效应关系，以及能否通过操控其表达改变相关干细胞的成骨能力，是需要进一步深入研究的问题。

Wnt通路是骨发育及骨代谢中最关键的信号通路之一。经典的Wnt/β-catenin信号在骨骼的发育和代谢方面有重要作用。用Prx1-Cre介导β-catenin在间充质干细胞中剔除，能阻断干细胞向成骨细胞的分化并导致异位软骨的发生，异位表达的Wnt能促进干细胞向成骨的分化，成熟成骨细胞中敲除β-catenin，骨吸收增加、骨量下降。有研究表明Wnt经典信号通路抑制成骨作用的原因是成骨细胞的转录因子的表达水平降低以及抑制在成骨过程中发挥重要作用的c-JNK以及P38MAPK，Wnt经典信号通路的高表达能够抑制hMSC形成新生骨。在成骨细胞分化的过程中多种分子信号通路在同时发挥着作用，而在成骨的过程中发挥关键作用的是非经典Wnt信号通路的Wnt5a，该分子信号通路中的Ror2、RhoA、N-钙粘连蛋白以及β-catenin信号通路在同时调控着细胞的成骨分化。在骨髓微环境中，β-catenin需要长期的表达来维护原始造血细胞的能力。另外，经典wnt通路通过转录因子TCF/LEF和FOXO与β-catenin特异性关联从而影响老化过程。这些转录因子的胞内水平以及它们在核内的定位与细胞老化密切相关。细胞内不同的wnt通路水平调控着老化过程。当β-catenin与TCF/LEF结合时，可以减缓老化;当β-catenin与FOXO结合时，可以加速细胞衰老。这些结果说明WNT通路水平有可能作为控制相关成骨干细胞衰老表型的关键因素。此外，研究发现经典Wnt通路抑制剂DKK2能促进成骨细胞终末分化并矿化，抑制DKK2后成骨细胞矿化受阻，表明DKK2在成骨细胞分化后期起重要调节作用。研究证明，不同类型Wnt通路分子在间充质干细胞( MSCs)定向分化过程中具有不同作用，经典Wnt信号通路的增强可导致MSC矿化功能受阻，而非经典Wnt通路分子Wnt-4表达的增强能促进MSC矿化并修复骨组织缺损。最新研究显示miR-204/211 在MSC成脂分化中表达上升，是Runx2的内源性负调节因子，在间充质干细胞中能够抑制成骨分化并促进成脂分化。有研究还发现miR-17家族与wnt通路密切相关，它可能通过作用于wnt通路下游的信号分子，改变其在蛋白水平的表达，对MSCs骨向分化能力进行调控。

Notch信号在多种细胞的增殖分化中起重要的调控作用，Shindo等将Notch1胞内结构域转染间充质干细胞，显示Notch信号的激活抑制了间充质干细胞的成骨分化，抑制了Cbfa1和Ose2的启动子活性，细胞的体外和体内成骨能力明显降低，同时，在体内形成的骨组织中，转染后较多见破骨细胞。此结果表明Notch信号逆向调节MSC的成骨分化，并且控制着破骨细胞的形成。另有研究显示Notch信号的过表达抑制软骨内成骨，通过抑制MSC骨向分化能力导致骨质减少;反之，Notch信号的条件性失活则可引起网状骨质容积的增加和骨向分化能力的增强，若Notch信号调节紊乱可导致脊椎肋骨发育不全等疾病。近年研究表明Notch靶基因之一Hey1在调控成骨分化时也是BMP-2的靶基因，说明Notch有可能通过与BMP共同调控下游基因控制细胞的成骨分化。此外，一些基因如Ctgf可通过抑制Notch增强成骨活动，表明Notch可介导其他基因对成骨分化的调控过程。

传统观点认为，OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞生成中起着至关重要的作用，然而近年研究发现，骨衰老过程中循环MSC数量逐渐增多，Runx2、Sp7、COL1A1、SPARC和SPP1等成骨相关基因表达逐渐下降，OPG/RANKL比值明显下降，表明OPG/Rankl/Rank信号调控着衰老过程中MSCs的功能。研究表明流体静态压力下MSC呈现OPG/RANKL比值下降表现，同时破骨活动增强，表明OPG/Rankl/Rank对细胞的成骨分化受到外界刺激的影响。利用Forskolin和IBMX增强蛋白激酶A( PKA)通路可提高间充质干细胞内OPG/RANKL比例从而抑制破骨活动，但同时又激发了MSCs的成脂分化倾向，说明OPG/ Rankl/Rank对MSCs成骨分化的调控同时受到多种因素的影响。此外，丁酸钠通过激活ERK通路调节OPG/RANKL比例从而控制MSCs的成骨分化，也是OPG/Rankl/Rank受到不同信号通路调节的证明。有研究发现大龄突变小鼠骨密度反而增强，可能与TGF-β1下降、RANKL/OPG轴改变导致的破骨活动降低有关。

影响骨发育的这些重要信号通路之间存在相互作用。FGF和Wnt通路能调节BMP信号的持续时间。β-catenin与TCF/LEF形成的复合体，能与Smad1、Smad3相互作用共同调节成骨细胞靶基因的转录。Notch1的过表达能通过下调Wnt信号通路抑制成骨细胞的分化。Notch信号本身受到金属蛋白酶ADAM的调控。Hedgehogs信号刺激时成骨细胞中Gli2介导BMP2的表达。有研究发现BMP-2促进Lrp5的表达并抑制beta-TrCP的表达，促进β-catenin在成骨细胞中的表达。体外敲除β-catenin基因抑制成骨细胞的增殖，改变其分化并且减少其在BMP-2处理下的成骨应答，表明BMP-2可能在一定程度上通过调节β-catenin信号调节成骨细胞的功能。此外，使用Axin2-lacZknockout( KO)小鼠探索Wnt-β-catenin信号在骨形成中的作用，在成年小鼠骨形成过程中Axin2是一种关键的负调节因子，通过β-catenin-BMP2/4-Osx信号通路调节成骨分化。研究证明蛇床子素通过β-catenin-BMP信号通路促进成骨细胞分化，蛇床子素能作为潜在的同化激素类药刺激骨形成，预防雌激素不足引起的骨丢失。以上研究均表明在干细胞中，多条信号通路之间存在相关作用，但是其具体的时间-空间调控网络如何尚需要进一步深入研究(图9-2)。

生物体从器官、组织到细胞等各个层次上的生命运动均是在一定力学环境中进行的。生物体本身处于外在的力学环境中，生物体内部还存在着静态或动态的力学相互作用，作为生命基本组成单元的细胞，其生存的力学环境非常复杂，越来越多的研究表明，机械刺激可以调节其功能的许多方面，包括生长、分化、迁移、基因表达、蛋白质合成和细胞凋亡。成骨细胞在机械应力的作用主要表现在对增殖和分化的影响。目前的研究业已证实，成骨细胞在受到机械应力作用后其表型基因和相关蛋白将发生变化。机械力刺激能激活细胞内的多条信号转导通路，这些通路将力学刺激信号传递到核内，最终产生细胞对力学信号的应答。

合适的力学刺激对于MSCs的增殖、分化和存活具有重要作用。废用性实验证明，当肢体失去力学刺激后，长骨内破骨细胞异常活化，同时成骨系细胞的骨形成能力也下降，导致骨质疏松的发生。同时，体外实验证明适当的力学刺激能够促进MSCs向成骨细胞分化。而当骨骼受力过大时，会导致松质骨内微骨折的发生，如果过强的应力持续，MSCs介导的骨再生修复无法及时修复不断加重的损伤，最终将导致病理性骨折的发生。体外实验也发现过度的力学刺激将影响MSCs的增殖和分化，甚至导致MSCs的凋亡。此外，有报道发现，骨骼及MSCs对于力学的感应不仅与力的大小有关，还跟施力的频率有关。持续性的力学刺激无法促进骨形成，而适宜频率的间断力学刺激则能有效的刺激骨的形成。

在衰老过程中，由于骨骼肌和神经系统的衰退，无论是老年个体行走的时间还是作用于骨骼的力均较年轻时有明显减少，这些都抑制了MSCs介导的骨再生和修复，加速骨质疏松的进程;而通过适当大小及频率的力学刺激，能够有效减缓衰老所致的骨质疏松。

能量对于全身每一个器官都至关重要，机体的新陈代谢和运动均需要消耗能量。同样，能量代谢也与衰老联系紧密。McCay等( 1935年)最早发现大鼠的寿命可通过生长期开始限制热量摄入而得到显著延长。Weindruch and Wolford( 1988年)，Masoro( 1988年)的研究发现，营养摄入限制达20%至40%程度时，动物寿命明显延长，生命质量亦明显改善。目前为止，这种限食对衰老的影响作用在许多物种都存在，尽管对有的生物进行饮食限控是非常困难的，难以获得准确的实验结果，然而这种现象在衰老研究中得到普遍认可。实验结果表明，营养素对衰老的影响，与其组成成分无关，主要由热能摄入总量的多少决定。最近的研究显示，饮食限制主要是通过抑制IGF信号通路发挥延长衰老的作用。一方面，营养素的限制可降低代谢过程，使对机体有害的ROS生成减少，损害减轻;另一方面，提高SOD和过氧化物酶的抗氧化作用，有效地控制ROS水平，也对机体产生有益的影响。尽管限食使抗氧化剂的生成减少，却相对提高了抗氧化剂的效能。适度节制饮食，使人体氧负荷降低，氧自由基产生减少，最低限度的影响DNA碱基交换、单链断裂，使细胞凋亡得以适当抑制，衰老相关变化得以延缓，使很多生理、生化行为的衰老变化延迟，最终获得寿命延长。

减少对能量物质的需求，有利于生物面对暂时的能源短缺，适应生存环境，限食对生物生理功能和寿命产生有益的影响。但是，对于骨骼发育来说，却存在一定的矛盾。一方面，在骨骼发育过程中需要充足的能量供应，研究显示青少年营养不良者平均骨密度低于营养正常的同龄人;在成年人群中，身体较为肥胖的人群在衰老过程中骨密度降低较缓慢，提示能量供应与骨密度呈正相关;另一方面，最新研究显示能量限制能够明显减缓心、脑、肝等器官的衰老进程，但是对于骨骼却没有明显的改善。这提示骨骼系统的衰老进程可能存在一定的特殊性。