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第一节 概 述
一、黄酮的结构与分类
（一）黄酮的结构 1.基本母核
黄酮类化合物基本结构为2-苯基色原酮，均具有C6-C3-C6的结构单元。
2-苯基色原酮
2.常见取代
黄酮类化合物结构中A、B环上常见的取代基有羟基、甲基、甲氧基及异戊烯基等。
3.组成黄酮苷的糖 （1）糖的种类：
天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，组成黄酮苷类的糖的种类主要有单糖类（D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等）、双糖类（槐糖、龙胆二糖、芸香糖等）以及三糖类（龙胆三糖、槐三糖等）和酰化糖类（2-乙酰基葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等）。
（2）糖的连接位置：
在黄酮氧苷中，黄酮、二氢黄酮和异黄酮类多与7-OH形成单糖链苷，黄酮醇和二氢黄酮醇苷类中多与3-OH、7-OH、3′-OH或4′-OH形成单糖链苷或与 3，7-二 OH、3，4′-二 OH 及 7，4′-二 OH 形成双糖链苷，花色素苷类多在3-OH上连接一个糖或形成3，5-二葡萄糖苷；在黄酮碳苷中，糖多连接在6 位、8 位或 6、8位都连接糖，如牡荆素（vitexin）、葛根素（puerarin）等。
牡荆素
葛根素
（二）黄酮的分类
一般根据黄酮类化合物A环和B环中间的三碳链的氧化程度、三碳链是否构成环状结构、3位是否有羟基取代以及B环连接的位置等特点进行分类，主要黄酮类化合物类型如下。
1.黄酮类
以2-苯基色原酮为基本母核且3位上无含氧基团取代，代表化合物有芹菜素（apigenin）、木犀草素（luteolin）、黄芩苷（baicalin）等 。
芹菜素
木犀草素
黄芩苷
2.二氢黄酮类
在黄酮母核的基础上2、3位双键被氢化，代表化合物有橙皮素（hesperitin）、甘草素（liquiritigenin）等。
橙皮素
甘草素
3.黄酮醇类
在黄酮母核的3位上连有羟基或其他含氧基团，代表化合物有山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）等。
山柰酚
槲皮素
4.二氢黄酮醇类
在黄酮醇母核的基础上2、3位被氢化，常与相应的黄酮醇共存于同一药用植物中，代表化合物有二氢槲皮素（dihydroquercetin）、二氢桑色素（dihydromorin）等。
二氢槲皮素
二氢桑色素
5.异黄酮类
母核B环连接在C环的3位上，代表化合物有大豆素（daidzein）、大豆苷（daidzin）等。
大豆素
大豆苷
6.二氢异黄酮类
在异黄酮母核的基础上2、3位被氢化，代表化合物有紫檀素（pterocarpin）、鱼藤酮（rotenone）等。
紫檀素
鱼藤酮
7.查耳酮类
由二氢黄酮C环的1、2位键断裂而成，其母核编号与其他黄酮类化合物不同。2′-羟基查耳酮衍生物为二氢黄酮的异构体，两者可以相互转化。代表化合物有红花苷（carthamin）等。
红花苷
8.二氢查耳酮类
为查耳酮α、β位双键氢化而成，目前发现的该类型化合物数目极少，如根皮素（phloretin）等。
根皮素
9.橙酮类
又称噢哢类，其特点是C环为五元环，主要存在于玄参科、菊科、苦苣苔科、莎草科等植物中，代表化合物有硫磺菊素（sulphuretin）等。该类型母核编号与其他黄酮类不同。
橙酮
硫磺菊素
10.花色素类
基本母核的C环无羰基，1位氧原子以离子形式存在。花色素类在植物中多以苷的形式存在，使植物的花、果、叶、茎等呈现蓝、紫、红等颜色，代表化合物有矢车菊苷元（cyanidin）等。
矢车菊苷元
11.黄烷醇类
该类型结构特征为C环饱和且无羰基，根据其C环的3、4位羟基取代特点又可分为黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二醇两类，代表化合物为（+）儿茶素（catechin）、无色矢车菊素（leucocyanidin）等。此类化合物在植物体内可作为鞣质的前体，常以分子聚合的形式生成鞣质。
（+）儿茶素
无色矢车菊素
12.双苯吡酮类
又称苯骈色原酮类，B环与C环由2、3位稠合而成，代表化合物有异芒果素（isomangiferin）等。
异芒果素
13.高异黄酮类
母核中C环与B环的连接比异黄酮多一个碳原子，目前已经发现的化合物虽然仅百余种，代表化合物有甲基麦冬黄酮A（methylophiopogonone A）等。
甲基麦冬黄酮A
14.双黄酮类
由二分子黄酮类化合物聚合而成。常见的天然双黄酮是由两分子的芹菜素或其甲醚衍生物构成，根据其结合方式可分为3′，8″-双芹菜素型、8，8″-双芹菜素型和双苯醚型等三类，代表性化合物有银杏素（ginkgetin）、柏黄酮（cupresuflavone）、扁柏黄酮（hinokiflavone）等。
银杏素
柏黄酮
扁柏黄酮
二、黄酮的主要理化性质
（一）物理性质 1.性状
黄酮类化合物多为结晶性固体，少数（黄酮苷类）为无定形粉末。
2.颜色
黄酮类化合物大多呈黄色，所呈颜色主要与分子中是否存在交叉共轭体系以及助色团种类、数目和取代位置有关。
（1）母核结构的影响：
一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄～黄色，查耳酮为黄～橙黄色；二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄烷醇2、3位双键被氢化，交叉共轭体系中断，几近无色；异黄酮因缺少完整的交叉共轭体系仅显淡黄色；花色素的颜色随pH不同而改变，一般pH<7时显红色，pH为8.5时显紫色，pH>8.5时显蓝色。
（2）取代基的影响：
在黄酮、黄酮醇分子中（尤其在7位或4′位）引入—OH及—OCH 3等供电子基团后，产生p-π共轭，促进电子重排，使共轭系统延长，化合物颜色加深。但—OH、—OCH 3引入分子结构中其他位置，则对颜色影响较小。
3.溶解性
黄酮类化合物的溶解性因结构类型及存在状态不同而有很大差异。
（1）游离黄酮类化合物：
一般难溶或不溶于水，易溶于醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。其中，黄酮、黄酮醇、查耳酮等为平面型分子，分子与分子间排列紧密，分子间引力较大，较难溶于水；二氢黄酮及二氢黄酮醇等因系非平面型分子，分子中的C环具有近似于半椅式的结构，分子与分子间排列不紧密，分子间引力降低，有利于水分子进入，故在水中溶解度稍大；异黄酮类化合物的B环受4位羰基的空间位阻影响，平面性受到影响，亲水性比平面型分子增加；花色素类以离子形式存在，故亲水性较强，在水中溶解度较大。
二氢黄酮
二氢黄酮醇
黄酮类化合物如果分子中引入的羟基增多，则水溶性增大，脂溶性降低；若羟基被甲基化后，则脂溶性增加。
（2）黄酮苷类：
黄酮苷一般易溶于水、醇而难溶或不溶于苯、三氯甲烷、乙醚等亲脂性有机溶剂，所含糖的数目和结合的位置对溶解度有一定影响。一般来说，多糖苷比单糖苷水溶性大，3-羟基苷比相应的7-羟基苷水溶性大。
（二）化学性质 1.酸性 （1）酸性来源：
黄酮类化合物分子中多具酚羟基，故显酸性，可溶于碱水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等溶剂。
（2）酸性大小的影响因素：
黄酮类化合物的酸性强弱与酚羟基数目多少和位置有关。一般而言，酚羟基数目越多酸性越强，酚羟基数目相同时则取决于酚羟基取代的位置。酸性由强至弱的顺序是：7，4′-二羟基取代>7-羟基取代或4′-羟基取代>一般酚羟基>5-羟基取代，其中，7，4′-二羟基取代者可溶于NaHCO 3水溶液，7位或4′位上有酚羟基者能溶于Na 2CO 3水溶液，具有一般酚羟基者只溶于NaOH水溶液，仅有5位酚羟基者酸性最弱，据此差异可以用于黄酮类化合物的提取、分离。
2.碱性
黄酮分子中1-位氧原子有未共用电子对，因此表现出微弱的碱性，可与强无机酸（浓硫酸、盐酸等）反应，生成极不稳定盐，加水后即分解。
3.显色反应
黄酮类化合物的显色反应主要基于分子中酚羟基及γ-吡喃酮环的性质。
（1）盐酸-镁粉反应：
该反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。向适量样品的醇溶液中加入少许镁粉，振摇，再滴加几滴浓盐酸，多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物为阳性结果，显红～紫红色。查耳酮、橙酮、儿茶素类该反应阴性，异黄酮类基本也不显色。
（2）钠汞齐反应：
在样品醇溶液中加入钠汞齐，放置数分钟至数小时或加热，滤过，滤液用盐酸酸化，则黄酮、二氢黄酮、异黄酮、二氢异黄酮类显红色，黄酮醇类显黄色至淡红色，二氢黄酮醇类显棕黄色，以此可以进行黄酮类型的鉴别。
（3）四氢硼钠反应：
四氢硼钠是二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物的专属性检识反应。取样品醇溶液加入适量NaBH 4，再滴加3～5滴稀盐酸，振摇，二氢黄酮类或二氢黄酮醇类被还原产生红色至紫红色，其他黄酮均为阴性结果，故可用于鉴别二氢黄酮类、二氢黄酮醇类和其他黄酮类化合物。该反应亦可在滤纸上进行。
（4）三氯化铁反应：
多数黄酮类化合物分子中含有酚羟基，故可与三氯化铁试剂发生显色反应，依分子中所含的酚羟基数目及位置的不同，可呈现紫、绿、蓝等不同颜色。
（5）三氯化铝反应：
凡具有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基结构的黄酮类化合物都可发生该反应。取样品醇溶液适量加入1%三氯化铝乙醇溶液3～5滴，溶液变为黄色，紫外灯下显示亮黄色荧光，但4′-羟基黄酮醇或7，4′-二羟基黄酮醇显天蓝色荧光。此反应亦可在滤纸上进行或将三氯化铝作为薄层色谱的显色剂。
（6）锆盐-枸橼酸反应：
5-羟基、4-羰基与锆盐生成的络合物不如3-羟基、4-羰基的锆盐络合物稳定，容易被弱酸分解。可以利用锆盐-枸橼酸反应鉴别黄酮类化合物分子中3-羟基或5-羟基的存在与否。取样品甲醇溶液适量加入2%二氯氧锆（ZrOCl 2）甲醇溶液，若出现黄色，则说明分子中有3-羟基或5-羟基与锆盐生成了络合物。再加入2%枸橼酸甲醇溶液，黄色不减褪示有3-羟基或3，5-二羟基，黄色显著减褪示有5-羟基而无3-羟基。此反应也可在滤纸上进行，得到的锆盐络合物斑点多呈黄绿色并有荧光。
（7）氨性氯化锶反应：
取样品的甲醇溶液适量加氯化锶（SrCl 2）的甲醇溶液3滴和被氨气饱和的甲醇溶液3滴，产生绿色至棕色乃至黑色沉淀为阳性结果。该反应是检识邻二酚羟基的特征反应。
（8）硼酸反应：
5-羟基黄酮及6′-羟基查耳酮在酸性条件下，可与硼酸反应产生亮黄色。在草酸存在下显黄色并具有绿色荧光，在枸橼酸丙酮存在的条件下只显黄色而无荧光，可以利用该反应与其他类型的黄酮类化合物相区别。
（9）碱性试剂反应：
黄酮类化合物与碱性溶液可生成黄色、橙色或红色等，对于鉴别黄酮类化合物的类型具有一定意义。具体反应现象为：①黄酮类在冷和热的氢氧化钠水溶液中能产生黄色至橙色。当分子中有邻三羟基取代时，往往产生暗绿色或蓝绿色纤维状沉淀；②黄酮醇类在碱液中呈黄色，通入空气后即转变为棕色；③二氢黄酮类在冷碱中呈黄色至橙色，放置一段时间或加热则呈深红色至紫红色；④查耳酮类或橙酮类在碱液中能很快产生红或紫红色。
（10）五氯化锑反应：
将样品溶于无水四氯化碳，加入2%五氯化锑的四氯化碳溶液适量，查耳酮类为阳性结果，生成红或紫红色沉淀，可用以与其他黄酮类化合物进行鉴别。由于在湿空气及含水溶液中产物不稳定，反应时需用无水溶剂。
三、黄酮的提取分离方法
（一）黄酮的提取方法
黄酮类化合物的提取一般采用溶剂法，主要依据目标化合物的性质、伴存的杂质以及药用部位等综合选择提取溶剂。若提取目标为总黄酮（既含有游离黄酮也含有黄酮苷），宜用浓度为70%及以上的乙醇回流提取。若分类提取，则需根据溶解性分别设计提取工艺。
1.游离黄酮的提取 （1）有机溶剂提取法：
大多数游离黄酮宜用亲脂性溶剂（如乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚等）以回流或连续回流法进行提取，极性较大的游离黄酮亦可用高浓度醇或醇-水溶剂系统提取。
（2）碱提酸沉法：
游离黄酮类成分大多具有酚羟基，因此也可用碱水或碱性稀醇溶液提取，提取液经酸化后黄酮类化合物被游离，可沉淀析出或用有机溶剂萃取得到。常用的碱水溶液为氢氧化钠水溶液和氢氧化钙水溶液，氢氧化钠水溶液浸出能力较强，但浸出杂质较多；氢氧化钙水溶液的优点是可以沉淀多羟基鞣质或含羧基的果胶、黏液质等水溶性杂质，有利于提取液的纯化，缺点是浸出率低于稀氢氧化钠水溶液且有些黄酮类化合物亦能被沉淀损失。5%氢氧化钠稀乙醇液也可以用于提取，浸出效果较好，但析出的黄酮类化合物在稀醇中有一定的溶解度，产品收率有所降低。用碱性溶剂提取时，所用的酸、碱浓度均不宜过高，当分子中有邻二酚羟基时可加硼酸保护。
2.黄酮苷的提取 （1）有机溶剂提取法：
黄酮苷类一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或极性较大的混合溶剂如甲醇-水等提取，提取方法可采取冷浸法、渗漉法和回流法、连续回流法等。
（2）热水提取法：
黄酮苷类含量较高的中药可以采取热水浸渍或煎煮提取。此方法成本较低、设备简单，适合于工业化生产，但蛋白质、糖类等水溶性杂质的干扰使后续的分离变得困难。同时，为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，应注意抑制酶的活性。
目前，除了采用传统的溶剂法提取黄酮类化合物之外，还可采用超声波提取法、微波提取法等新技术进行提取，可显著提高提取效率，缩短提取时间、提高药材利用率。同时，也可采用超临界流体萃取法，特别适用于热敏性和易氧化的黄酮类化合物。
（二）黄酮的分离方法
黄酮类化合物的分离主要根据溶解性差异、酸性差异、分子量差异以及有无特殊结构等进行，各种色谱技术在黄酮类化合物分离中应用较为广泛。
1.溶剂萃取法
总黄酮的醇提取液适当回收溶剂，然后用不同极性的溶剂进行萃取，可使游离黄酮与黄酮苷分离或使极性较小与极性较大的黄酮分离。另外，也可应用溶剂萃取达到精制纯化目的，如可用石油醚萃取除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素等杂质。
2.pH梯度萃取法
该法主要适用于酸性具有显著差异的游离黄酮类化合物的分离。将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用NaHCO 3萃取出7，4′-二羟基取代黄酮、Na 2CO 3萃取出7-羟基黄酮或4′-羟基黄酮、0.2%NaOH萃取出具有一般酚羟基的黄酮、5%NaOH萃取出5-羟基黄酮，从而达到分离的目的。
3.硅胶柱色谱法
该法是目前分离黄酮类化合物采用较多的一种方法，主要适宜分离中等极性及中等极性以下的黄酮类化合物。分离游离黄酮时，一般选择不同比例的三氯甲烷-甲醇混合溶剂等为洗脱剂，分离黄酮苷时常用含水的溶剂系统洗脱，如三氯甲烷-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水等。
4.聚酰胺柱色谱法
聚酰胺柱色谱对各种黄酮类化合物都有较好的分离效果。
（1）分离原理：
聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与黄酮类化合物分子中的酚羟基形成氢键缔合而产生的，吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中酚羟基的数目与位置等。
（2）洗脱溶剂：
先用水洗脱，除去水溶性杂质，再以浓度由低到高变化的醇溶液依次洗脱。
（3）洗脱规律：
①黄酮类化合物分子中酚羟基数目越多则吸附力越强，在色谱柱上越难以被洗脱；②分子中酚羟基数目相同时，若酚羟基所处位置易于形成分子内氢键，则其与聚酰胺的吸附减弱、易被洗脱下来；③分子内芳香化程度越高、共轭双键越多，吸附越强；④不同类型黄酮类化合物被吸附强弱的顺序为：黄酮醇>黄酮>二氢黄酮醇>二氢黄酮>异黄酮；⑤分离总提取物中的游离黄酮与黄酮苷时，以含水移动相为洗脱剂时，黄酮苷先洗脱下来；以有机溶剂（如三氯甲烷-甲醇）为洗脱剂，游离黄酮先洗脱下来。
5.葡聚糖凝胶柱色谱
Sephadex G型及Sephadex LH-20型凝胶常用于黄酮类化合物的分离。
（1）分离原理：
分离游离黄酮时主要基于吸附作用，因吸附力的强弱不同而分离。分离黄酮苷时主要基于分子筛作用，黄酮苷的分子量越大越容易被洗脱。
（2）洗脱溶剂：
主要有氨水溶液、含盐水溶液、醇及含水醇以及含水丙酮、甲醇-三氯甲烷溶剂系统等。
（3）洗脱规律：
游离黄酮的酚羟基数越多越难以洗脱，而黄酮苷分子上连接的糖数目越多、分子量越大越容易洗脱。
6.大孔吸附树脂色谱法
该法提取率较高、成本相对低，目前已较多地用于黄酮类化合物的分离富集，尤其适合工业化生产。分离过程中，大孔树脂的种类、样品液浓度、pH、流速、洗脱剂的种类和用量等因素均会对分离效果产生影响。
7.制备型高效液相色谱法
应用制备型高效液相色谱技术已成功分离了大量黄酮类化合物。常采用反相高效液相色谱进行分离，洗脱剂常用含一定比例的甲酸或乙酸的甲醇-水或乙腈-水溶剂系统。对于多甲氧基黄酮或黄酮类化合物的乙酰物可用正相色谱，流动相一般采用乙烷或异辛烷等并以乙醇、丙醇、乙腈等调节极性。
8.氧化铝柱色谱法
氧化铝对黄酮类化合物吸附力较强，特别是具有邻二氧结构（3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基）的黄酮类化合物可与铝离子络合而被牢固地吸附在氧化铝柱上，相对难以洗脱。当黄酮类化合物分子中没有上述结构或虽有上述结构但羟基已被甲基化或苷化时，也可用氧化铝柱分离，例如葛根中异黄酮类化合物的分离。