直接显微镜检查，是临床检验浅部真菌病最常用、最快速、最便捷的方法，操作简单，尤其适合在基层医院推广。直接镜检的缺点是阳性率低，多次送检可提高阳性率。阳性镜检结果可确诊相对应的真菌感染。

操作方法：将待检物置于1张清洁玻片中央，滴1滴10%KOH溶液于待检物上，使待检物透明化；盖上盖玻片，轻轻压平使待检物分布均匀；将玻片在酒精灯上轻微快速加热2～3次，置于显微镜下观察。先将显微镜光圈调至暗视野，在低倍镜下找到真菌成分位置，后转高倍镜在亮视野下观察真菌的形态、大小、数量等。为更好地观察真菌形态，可在盖上盖玻片后，在盖玻片一侧缘滴1滴乳酸酚棉兰（或苯胺蓝）染液，对侧缘用纸巾轻轻将KOH溶液吸干，待真菌染色后进行镜下观察。

皮肤黏膜真菌病常用的染色方法包括：过碘酸希夫（PAS）染色、革兰氏染色（Gram stain）、抗酸染色。在上述三种染色法中，真菌分别呈鲜红色、蓝黑色、红色。

真菌培养是诊断真菌病的金标准，其旨在鉴定菌种及提高真菌检查阳性率。皮肤黏膜真菌病常规使用的真菌培养基包括加抗生素沙氏琼脂培养基（SDA）、橄榄油培养基、皮肤癣菌培养基（DTM），而非常规使用的显色培养基可用于念珠菌的种间鉴别。

大多数真菌培养的最适温度为30℃，而对于疑似双相真菌感染的标本，宜分别置于25℃、37℃孵箱培养。

临床中培养出来的真菌不一定是致病菌，而经特殊染色后的组织病理切片中发现真菌和真菌感染后病理学改变，即可确诊真菌感染。相当一部分真菌感染的组织病理切片中并不能找到典型真菌结构，免疫组织化学技术的发展则为解决这一难题提供契机，并成为特异度仅次于真菌培养的检查方法。