沙眼衣原体的实验室诊断技术发展经历3个阶段。第一阶段是沙眼衣原体细胞培养，即通过细胞培养来证明衣原体包涵体的存在。第二阶段是非培养阶段，相继建立了酶免疫方法（EIA）、直接免疫荧光法（DFA）和免疫层析法（ICT），直接检测标本中沙眼衣原体抗原。第三阶段是核酸扩增技术（nucleic acid amplification test，NAAT），如荧光PCR、链置换扩增技术、转录介导等温扩增技术等。

培养法曾经被认为是检测沙眼衣原体感染的“金标准”方法。然而，由于该法检测敏感性较低（50%～80%），且设备和操作技术要求高，标本运输需低温以保持沙眼衣原体的活性，试验周期长（需3～5天），标本要求高，因此，仅在专业实验室开展，用于科学研究、抗生素敏感性试验和方法学评价等。目前美国CDC在男童性侵和女童的生殖道外部位的感染推荐使用该方法。

抗原检测方法是基于检测衣原体特异性抗原的非培养技术，操作简便快速，包括ELISA、DFA和快速免疫层析法。目前国内没有商品化的沙眼衣原体抗原ELISA检测试剂。直接免疫荧光法可快速检测临床标本，与培养方法比较，符合率达85%以上，该方法在检测女性宫颈标本中一致性高于男性尿道标本。免疫层析法因具有“床边”操作、及时性、无需复杂的设备等优点而被广泛应用，评估结果显示免疫层析法的特异性较高（97%～100%），但其灵敏度较低。各种标本检测的敏感性不同，阴道拭子的敏感性平均为37%（17.1%～74.2%），宫颈拭子的敏感性平均为53%（22.7%～87%），尿液的敏感性平均为63%（49.7%～88.2%）。

最先开发的沙眼衣原体和淋球菌核酸检测技术是直接检测核酸技术（nucleic acid hybridization，NAH），但是NAH的方法其敏感性较低。随着核酸扩增技术的出现，这类方法逐步被取代。目前所有美国FDA批准的商品化核酸扩增检测产品均可适用于男性的尿液和尿道拭子，女性的宫颈分泌物、阴道分泌物及尿液。该方法应用于女性宫颈拭子、阴道拭子和尿液敏感性达90%以上，特异性达99%以上；应用于男性尿液敏感性达95%以上，特异性达99%以上。国内的实时荧光PCR检测敏感性为88.89%～100%，特异性为97.59%～100%；但国内实时荧光PCR检测目前适用的标本主要为男性尿道拭子和女性宫颈拭子，尚不能应用于无创性标本（男性尿液、女性阴道拭子及女性尿液）的检测。国内外所有的核酸检测试剂目前对生殖道外的标本如直肠和咽部拭子均未被批准应用，因此建议在生殖道外部位检测出阳性的标本时，仍需要进一步的试验排除假阳性。

每个沙眼衣原体含有7～10个拷贝的隐蔽性质粒DNA，1个染色体DNA，因此应用隐蔽性质粒DNA的检测敏感性较染色体DNA高。然而，2006年瑞典发现了一种新型沙眼衣原体变异株：沙眼衣原体隐蔽性质粒发生377bp碱基缺失。由于该区域的缺失，导致以隐蔽性质粒DNA区域作为扩增靶基因的某厂商核酸扩增试剂的漏检。至2007年，新型沙眼衣原体变异株在瑞典的广泛流行，流行率达到沙眼衣原体感染病例的20%～65%。之后，欧洲的丹麦、法国、爱尔兰和挪威的调查也先后发现该变异株，且感染病例与瑞典病例有流行病学联系。同时英国发现了无质粒型沙眼衣原体感染，且阿奇霉素治疗失败。这种质粒缺失或无质粒型沙眼衣原体的漏检，导致其相对于野生型沙眼衣原体具有一种选择优势。因其不能及时被发现和治疗而造成持续性感染与更广泛的传播。后来新研发试剂盒选择隐蔽质粒为靶基因的同时，增加了另一对位于染色体DNA的一段保守序列引物，以此保证能够检测出瑞典的沙眼衣原体新变种，从而控制了该变异株的广泛传播。

血清学试验对泌尿生殖道沙眼衣原体检测的敏感性和特异性不高，目前不推荐应用于急性无并发症的泌尿生殖道的感染诊断和筛查。在许多患者中，仅有侵入性沙眼衣原体才可以导致产生的抗体水平达到可检测的量，抗体水平可以保持许多年，但个体差异较大。