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第二节 细胞培养法
1.检测原理
沙眼衣原体自身不能产生三磷酸腺苷（ATP），需依赖于宿主细胞提供。某些肿瘤细胞系可作为沙眼衣原体易感细胞，经化学物质处理和离心使衣原体吸附于易感细胞。在适宜的培养条件下，沙眼衣原体以EB的形式侵入宿主细胞，被细胞膜包裹形成包涵体。内化的EB分化成代谢活跃、体积较大且有分裂能力的RB，RB以二分裂的方式增殖并发育为成熟的子代EB，包涵体逐渐胀大，48～72小时后包涵体和宿主细胞破裂释放出成熟的EB，再重新感染易感细胞。培养物经染色后于显微镜下可见包涵体。
2.检测准备 （1）仪器设备：
CO 2培养箱、倒置显微镜、生物安全柜、细胞培养瓶、细胞培养板、低温冰箱或液氮罐、离心机及水浴锅等。
（2）细胞株：
常用的敏感细胞株有McCoy、HeLa229或BHK-21细胞等。
（3）检测试剂：
胰酶-EDTA液、标本运输培养基、衣原体生长培养基、衣原体分离培养基、碘染色液、姬姆萨染色液（试剂配置详见附录）及衣原体荧光单克隆抗体试剂（见衣原体荧光法检测）等。
3.标本采集
（1）细胞培养：支持多种标本类型，包括男性尿道标本、女性宫颈标本、直肠标本、口咽标本，眼结膜等标本，采集方法同核酸检测。
（2）鼻咽部位标本：拭子从鼻孔插入至咽后壁，转动取样。
（3）采集标本洗脱于运送培养基中保存在普通冰箱（2～8℃）内，24小时内接种，超过24小时接种应放置于低温冰箱（-70℃）保存。
4.检测流程 （1）细胞复苏：
将冻存的细胞管放置于37℃水浴中速溶（1分钟内），将已复温融化的细胞全部转移至已含有10ml RPMI 1640培养液的15ml离心管中，1 000×g，离心5分钟，弃去上清液，加入适量培养液混匀后接种于培养瓶中，接种浓度1×10 6/ml左右，37℃，5%CO 2环境下培养过夜。次日更换生长培养基，观察生长情况，及时传代。
（2）单层细胞制备：
根据试验的目的可以选用不同孔的培养板进行试验，以下的步骤以96孔培养板为例，其他孔培养板可参照表3-1的比例进行调整。提前将已灭菌处理0.25cm 2的盖玻片放入培养板孔内，注意观察盖玻片是否平铺于培养板孔中。加入适量的细胞及培养液，37℃、5%CO 2环境下培养48小时，镜下观察细胞的形态及密度，待形成均匀覆盖孔底的单层细胞。
表3-1 不同规格的培养板的特征
（3）标本接种与感染细胞：
将保存于冰箱的标本放置于37℃水浴中速融。在已接种细胞的培养板孔中加入适量标本，每份标本接种2孔。同时每板设有阳性和阴性对照孔。将接种后的培养板放置于22～35℃、3 000×g条件下离心1小时。去除标本液，每孔加衣原体分离培养基0.1ml，放置于37℃、5%CO 2环境下培养48小时，观察结果。试验孔处理：第一孔（放入的盖玻片上）进行碘染色、姬姆萨染色或荧光单抗染色。如第一孔阴性，则第二孔进行盲传，如为阳性，则保存菌种。
（4）染色鉴定：
沙眼衣原体培养后可以通过碘染色和姬姆萨染色进行初步鉴定，通过直接免疫荧光法进行确证。
1）碘染色：
弃去培养孔中的培养液，每孔加入0.2ml甲醇，固定感染细胞10分钟，弃去甲醇后加碘染色液染5～10分钟。在玻片上滴加1μl碘甘油封片，取出盖玻片，将细胞面朝下放在封固液上，显微镜下观察结果。
2）姬姆萨染色：
培养孔弃去培养液，每孔加入0.2ml甲醇，固定感染细胞10分钟，弃去甲醇后加姬姆萨染色液染30分钟，在玻片上滴加1μl碘甘油封片，取出盖玻片，显微镜下观察结果。
3）直接免疫荧光法：
感染细胞用甲醇/丙酮固定10分钟，弃去甲醇后加荧光标记单克隆抗体，37℃孵育30分钟，洗涤数次，取出盖玻片放置于载玻片上，用碱性甘油封片后在荧光显微镜下检查。
（5）结果判读：
沙眼衣原体培养阳性时，碘染色镜检可见细胞内深棕色包涵体；姬姆萨染色可见细胞内紫红色包涵体；荧光单抗染色可见苹果绿色荧光的包涵体和原体颗粒。
5.结果报告
（1）可见沙眼衣原体生长。
（2）未见沙眼衣原体生长。
6.临床意义
临床标本中见沙眼衣原体生长可作为诊断生殖道沙眼衣原体感染的依据，但培养法灵敏度不高，因此临床标本未见沙眼衣原体生长时不能排除患者有生殖道沙眼衣原体感染。
7.注意事项
（1）棉拭子含有对衣原体生长有影响的物质，取材后立即将标本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。
（2）标本取材后尽快接种，24小时内不能接种应放置-70℃冰箱。
（3）尿液、精液标本及服过抗生素和使用阴道制剂的患者标本不宜做衣原体培养。
（4）单层细胞制备时如果细胞生长过密，包涵体染色过暗，则应降低培养中的细胞浓度。
（5）细胞生长稀疏、条束化，不能成片或被污染时，则应重新复苏细胞培养。细胞传代次数超过5代不可进行培养实验。
（6）胎牛血清质量对细胞生长影响很大，应选择质量合格的血清。
（7）放线菌酮的浓度对于衣原体生长影响较大，应根据实际情况而定。