上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
第一节 核酸检测
沙眼衣原体的核酸检测方法主要有实时荧光PCR、链置换扩增技术、转录介导等温扩增技术及基因测序技术等。通过扩增沙眼衣原体的7.5kb隐蔽性质粒DNA、染色体DNA或 23S rRNA、 16S rRNA等靶基因来检测病原体。本节以实时荧光PCR法为例进行介绍。
1.检测原理
实时荧光PCR法通过扩增沙眼衣原体7.5kb的隐蔽性质粒、染色体DNA等靶基因来检测病原体。实时荧光PCR法是在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量。
2.检测准备
根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求，核酸扩增检测实验室原则上应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。根据不同的检测区域配备以下材料及设备。
（1）实验消耗品：
一次性手套、耐高压处理的离心管、带滤芯加样器吸头、专用工作服和工作鞋等。
（2）仪器设备：
实时荧光PCR仪、离心机、生物安全柜、水浴锅或加热模块、普通冰箱、低温冰箱、微量加样器、紫外灯及混匀器等。
（3）检测试剂盒：
包括DNA提取液、PCR反应液、临界阳性质控品、阴性和阳性质控品及阳性定量参考品等。
3.标本采集 （1）尿液采集：
采集清晨首次尿液或至少禁尿1小时后的尿液，用无菌、无防腐剂的塑料器皿收集10～20ml前段尿液。
（2）尿道拭子 1）男性：
取材前1小时内不应排尿，采用男性拭子插入尿道内2～3cm，以旋转方式轻轻转动并保留5～10秒后取出。
2）女性：
可用手指自耻骨联合后沿女性尿道走向轻轻按摩尿道，用同男性相似的方法取材。
（3）宫颈拭子：
采样时先用生理盐水湿润的扩阴器扩阴，无菌棉拭子清除宫颈口外面的分泌物，再将女性取材拭子插入宫颈管内1～2cm，稍用力转动，保留5～10秒后取出。细胞刷采样，无菌棉拭子清洁宫颈口外表面，然后将细胞刷插入宫颈管内1～1.5cm，旋转数圈，停留数秒后取出。孕妇不应选择细胞刷采样方法。
（4）肛拭子：
将取材拭子插入肛管2～3cm，接触侧壁10秒，从紧靠肛环边的隐窝中采集分泌物。被粪便严重污染的拭子必须丢弃，更换拭子后重新取材。
（5）口咽拭子：
用压舌板固定舌头，用拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，反复擦拭3～5次采集分泌物。
（6）阴道拭子：
对青春期前女孩，将取材拭子放置于阴道后穹窿10～15秒，采集阴道分泌物。对于处女膜完整的幼女需采用男性拭子，可通过处女膜孔采集阴道标本。
常规阴道拭子采集可用温盐水湿润阴道窥器，轻轻按压子宫，打开窥器，使用试剂盒推荐的采样拭子放置于阴道后穹窿10～15秒，采集阴道分泌物。
（7）眼结膜拭子：
翻开下眼睑，从眼角向中间轻轻用拭子擦拭下眼结膜表面采集分泌物。
标本采集后按照各试剂说明书的要求进行标本保存。
4.检测流程
检测流程主要有标本洗脱、提取、扩增和检测。
检测前将所有试剂平衡至室温，充分混匀后，通过瞬时离心将管盖的液滴移除至管中。
（1）标本洗脱和DNA提取：
主要采用的方法有煮沸法和磁珠法。
1）煮沸法
标本处理：将标本充分洗脱至无菌生理盐水中，离心后弃上清，在沉淀物中加无菌生理盐水后并再次离心后弃上清。
DNA提取：在沉淀中直接加DNA提取液充分混匀，100℃条件下进行DNA的裂解。离心后上清待用。
2）磁珠法
标本洗脱：待检测的标本加入适量带有磁珠的标本洗脱液，充分振荡混匀，适宜的温度进行孵育。
DNA提取：将待测标本管放置于磁珠分离装置中，静置，待磁珠完全吸附于管壁后，吸弃液体，保留磁珠。
DNA纯化：加入洗涤液洗涤磁珠，充分振荡混匀，将待测标本管放置于磁珠分离装置中，静置，待磁珠完全吸附于管壁后，吸弃液体，保留磁珠。加入扩增检测液至待测标本管中，充分混匀后取混合液作为扩增模板进行PCR反应。
（2）质控品处理：
阴性、阳性及临界质控品同标本处理方法相同。
（3）加样：
取已含有扩增反应液和Taq酶的PCR反应管，按要求分别加入处理后的标本DNA提取液、阴性及阳性质控品的上清液，阳性定量参考品，离心后放置于实时荧光PCR仪中。
（4）PCR扩增及检测：
按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及待检标本，并根据试剂说明书要求设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件，进行扩增。扩增过程一般包括变性、退火、延伸3个步骤，检测主要是采集荧光信号。
（5）结果判读：
扩增检测结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节基线的起始值、终止值以及阈值。阈值设定的原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。仪器自动判断测定结果。阴性质控品、阳性质控品、阳性定量参考品均应在有效范围内，否则无效。增长曲线不呈S型或循环阈值（cycle threshold，Ct）值大于等于给定值为阴性结果。增长曲线呈S型或Ct值小于给定值为阳性结果。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义
（1）临床标本中检测到沙眼衣原体DNA阳性可作为沙眼衣原体感染的诊断依据。
（2）该检测用于临床判愈时，至少需在疗程完成后3周进行。
7.注意事项
（1）医疗机构应按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》及《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求开展核酸扩增检测工作。
（2）根据使用仪器的功能，各检测区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区和扩增产物分析区可合并；采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区及扩增产物分析区可合并。实际的检测流程按照试剂说明书要求进行操作。
（3）临床标本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。所有废弃物的处理需符合相关的法规要求。
（4）用于扩增的试剂，应避光保存并避免反复冻融；所有试剂在使用前，需在室温下充分混匀后并进行瞬时离心，使管盖及管壁上的液体离心至管底；PCR反应管反应前需进行瞬时离心。