梅毒病原学检测是一期、二期梅毒确诊的重要依据，是WHO指定的性病实验室必备项目之一。病原学检测中，暗视野显微镜检查多用于一期梅毒的螺旋体检测，暗视野显微镜检查的敏感性和特异性分别为74%～86%和85%～100%。国内有研究者报道镀银染色对一期梅毒的检出率（97.3%）要高于暗视野显微镜检查法（72.8%）。核酸扩增试验对一期梅毒皮损部位标本检测的敏感性为80%～90%，特异性为95%～99%，对二期和三期梅毒的血液检测敏感性均低于50%。

非梅毒螺旋体血清学试验，包括VDRL、RPR和TRUST，其检测符合率基本相同，用于血清检测时敏感性为71%～100%，特异性为96%～99%；VDRL用于神经梅毒脑脊液检测时特异性高，即假阳性低，检测阳性可以作为神经梅毒确诊依据，但敏感性较低，即阳性检出率低，假阴性高，所以检测阴性不能排除神经梅毒。VDRL所用抗原需要新鲜配制，并需要显微镜读取结果，我国目前尚无商品化试剂盒。RPR和TRUST作为VDRL的改良，采用了稳定可储存的抗原，同时增加了可供肉眼观察的指示物，使操作流程更加简便，为目前临床常规采用的方法。虽然3种检测方法的原理基本相同，但任意两种方法的定性和半定量结果，相互间不可直接比较。非梅毒螺旋体血清学试验在某些急性感染或慢性免疫性疾病时，身体亦会出现此类反应素，造成生物学假阳性。少数患者经过足量驱梅治疗和定期随访后，体内的梅毒非特异性抗体仍维持在相对恒定的低浓度状态（称作血清固定现象）。

梅毒螺旋体血清学试验中，FTA-ABS具有较高的准确性，除一期梅毒的敏感性为70%～100%外，其他期梅毒的检测的敏感性为96%～100%，特异性为94%～100%。但该方法对操作人员要求高，操作费时，结果的判读容易受主观因素影响。此外，该方法在孕期、自身免疫病以及恶性肿瘤情况下偶尔会出现生理学假阳性。TPPA和TPHA两种试验原理类似，但目前TPPA的使用更为广泛，检测敏感性根据疾病进程及病期为82%～100%，特异性达到99%。ELISA采用重组梅毒螺旋体特异抗原包被微孔板，检测血清中抗IgM和抗IgG抗体，纯化的基因重组抗原提高了特异性，酶的放大效应提高了检测灵敏度。但针对抗IgM抗体的ELISA对梅毒活动期的检测敏感性较低，不能确定疾病分期和评估治疗效果。ELISA自动化程度高，结果客观易读，适合于人群大规模的筛查和血制品梅毒筛查，其敏感性随疾病进程波动，为85%～100%，特异性为96%～100%。CLIA是ELISA的发展，使用酶标记的重组抗原，与标本中的抗体形成双抗体夹心，与发光底物结合后在化学发光仪上检测。目前此种方法已开发成全自动化模式，不仅适合于人群大规模的筛查和血制品梅毒筛查，也适合小样本实验室检测，敏感性为99%～100%，特异性亦可达到99%。但是这种检测方法需要专业的配套机器。WB法操作技术要求较高，适合于有一定条件的实验室开展。WB-IgM试验对婴儿先天梅毒的检测敏感性为78%，特异性为98%。ICT可在缺乏实验室条件的地区或现场筛查，其敏感性为85%～100%。目前已开发出能同时进行梅毒螺旋体血清学试验和非梅毒螺旋体血清学试验或梅毒和艾滋病双检测的快速检测试剂盒，但检测低滴度标本非梅毒螺旋体抗体的敏感性和特异性有待进一步提高。