肝胆胰肿瘤

肝癌是恶性程度极高的肿瘤之一，其患者的发病率和死亡率都位居恶性肿瘤前列。中国是肝病大国，也是肝癌大国。肝癌由于预后差、死亡率高、不易早期诊断等特征，素有“癌中之王”之称，也是严重危害中国人健康的重大疾病。其中，肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的90%。目前，肝细胞癌的治疗策略主要是依据巴塞罗那分期系统（BCLC）对患者进行分层治疗。根据肿瘤大小、肿瘤数目、血清AFP含量、血管侵犯、淋巴结和远端转移情况以及显微镜下肿瘤组织细胞类型、分化程度等组织细胞学特征，BCLC分级系统将HCC患者分为五个层级：极早期（BCLC，0期），早期（BCLC，A期），中期（BCLC，B期），中晚期（BCLC，C期）和晚期病人（BCLC，D期）。手术治疗、肝移植和局部消融是早期HCC患者（包括BCLC，0期和A期）的优选治疗方。然而，临床实践中人们发现，即使同处于BCLC早期的肝细胞癌患者，采用相同的治疗策略，其疗效却有很大区别，且仍有30%～50%的早期HCC患者会发生复发和转移。为何会存在如此大的差异？

随着基因组测序技术的发展，科学家们认识到肿瘤异质性是造成此种差异的主要原因。异质性是肿瘤的重要特征之一，是指相同肿瘤类型的不同患者之间或者同一患者体内不同部位的肿瘤组织之间具有遗传学和表观遗传学的差异。差异主要反映在遗传背景、肿瘤分化、表观表型、基因和转录组图谱、蛋白质表达谱等诸多方面，体现了肿瘤发生发展过程中的高度复杂性和多样性。这些特性赋予了肿瘤的个体差异，即在同一病理类型的肿瘤中，不同患者的肿瘤发生发展机制可能存在巨大差异。如何认清肿瘤异质性，精准的打击肿瘤，是目前肿瘤研究领域重要的科学命题之一。近年来，基于基因组数据分析，科学家们建立了多种类型的HCC分子亚型，并对其特征基因和生物学信号通路进行深入解析，为HCC的诊疗提供的新思路。虽然基因组学的进步对HCC的精准医疗起到了极大的推动作用，但至今未有比较权威的、规范的、统一的HCC分子亚型可应用于临床医学研究。

蛋白质组学是基因组研究逻辑上的延续，也是基因组生物学意义上的拓展与深化。蛋白质作为细胞功能活动的直接执行者，可以弥补和拓展基因组研究所不能提供的信息。随着蛋白质组学研究技术的进步，蛋白质组学已在很多重大疾病的生物标志物发现、分子机制研究及药物开发等方面展现了巨大的潜力。因此，将蛋白质组学应用于早期肝细胞癌研究，有助于深入了解肝癌的疾病特征，发现肝细胞癌的早期诊断、预后评估和精准分型的生物标志物以及潜在的药物治疗靶点，并为肝癌的精准医疗奠定基础。

本研究共收集了110例肝细胞癌患者的癌组织及其配对的癌旁组织作为研究对象。依据BCLC分级系统的临床分级评估，所有患者都属于原发性的早期肝细胞癌，即处于BCLC 0期和A期的肝细胞癌。全部患者在手术前均未进行放疗、化疗以及其他治疗。本研究收集的临床信息包括性别，年龄，血清AFP含量，肿瘤直径，肿瘤数目，有无HBV病毒感染，有无肝硬化，有无淋巴转移，有无脉管癌栓，有无复发，有无死亡，无病生存期，总生存期，BCLC临床分期等指标。

本研究利用Thermo Fisher Orbitrap Fusion质谱仪对110例早期肝细胞癌的癌和癌旁组织进行了蛋白质组的质谱分析，通过双成分混合模型检验分析，去除了存在蛋白质降解的9例癌组织和12例癌旁组织样本。剩余101例癌组织和98例癌旁组织的蛋白质组数据，作为核心数据集被用于后续生物信息分析，首次描绘了早期肝细胞癌的蛋白质组表达谱。

在101例癌组织和98例癌旁组织的蛋白质数据中，本研究共鉴定到9.252个蛋白质。其中，癌和癌旁组织单独鉴定到的蛋白质数目分别为349个和15个，共同鉴定到的蛋白质数目为8 888个，癌旁组织样本的平均蛋白质鉴定总数为5 114个，癌组织样本的平均蛋白质鉴定总数约为5 953个。无论从样本数目，还是蛋白质鉴定数目上，此套数据是目前最大规模的肝癌蛋白质组鉴定数据集。

此外，研究统计了98例具有配对癌和癌旁组织样本的蛋白质鉴定数据，发现同一患者的癌组织蛋白鉴定数显著高于其癌旁组织。在癌组织的样本群体中，研究还发现血清AFP含量高的患者（>200ng/ml，AFP+）或具有脉管癌栓的患者（MVI+）相较于血清AFP含量低（≤ 200ng/ml，AFP-）且无脉管癌栓（MVI-）的患者，其蛋白质鉴定数目更多，并具有统计学意义。其规律告诉我们，在癌和癌旁组织间，在恶性肝细胞癌患者（AFP+和MVI+患者）和良性肝细胞癌患者（AFP-和MVI-患者）的蛋白质表达谱间存在显著差异，而且这种差异极有可能与肝细胞癌的发生发展密切相关。

通过有监督的修正t检验统计分析，共鉴定到1 989个早期肝细胞癌癌和癌旁的差异表达特征蛋白质，包括1 631个上调蛋白质和358个下调蛋白质（图2a）。其中，上调表达蛋白质包含了大量的与肝细胞癌发生发展密切相关的蛋白质分子，如GPC3等；与细胞增殖相关蛋白质，如MCM家族蛋白质，PCNA等；肿瘤转移相关的蛋白质，如LAMB1，LAMA4，MMP14等。下调表达的蛋白质中主要包括肝脏细胞代谢功能相关蛋白质，如CYP4F12，CYP1A2和UGT2B15等。1 989个差异表达蛋白的丰度在癌和癌旁组织之间存在显著差异，表明这些蛋白质具有诊断肝细胞癌的潜能。

随后，我们利用Fihser精确检验对1 989个早期肝细胞癌的特征蛋白质进行了功能注释。其中上调表达的蛋白质主要富集于4大生物学功能模块：细胞增殖；肿瘤细胞转移信号通路；免疫反应信号通路；信号转导通路MAPK通路，NOTCH信号等。下调表达的特征蛋白质则主要富集于肝脏功能相关的代谢通路，预示着在肝细胞癌中肝脏正常的代谢功能显著下调。

基于101例癌组织样本的蛋白质组数据，研究利用非负矩阵分解（NMF）算法将101例患者分成了三大亚类，并将其命名为S-Ⅰ，S-Ⅱ和S-Ⅲ。通过临床关联性分析，研究发现S-III型中血清AFP含量高和具有脉管癌栓的患者比例明显高于S-I和S-II。

借助时序检验（log-rank test）和Kaplan-Meier生存分析对蛋白质组分子亚型间患者的总生存时间（overall survival，OS）和无病生存时间（disease free survival，DFS）进行分析，并利用Roessler等提供的一套开源肝细胞癌转录组数据集进行了外部验证。分析显示，在蛋白质组数据集和外部数据集中，S-III型患者的总生存率均显著低于S-I型和S-II型。在蛋白质组数据集中，S-III型患者的无病生存率也低于S-I型和S-II型，但并无统计学差异。而在外部数据集中，S-III型患者的无病生存率显著低于S-I型和S-II型。以上结果提示S-III型的肿瘤恶性程度更高，具有较差的预后。

此外，本研究还利用单因素和多因素Cox风险回归模型对蛋白质组分子亚型的预后情况做了进一步评估（附表1）。在蛋白质组数据集中，Cox单因素分析结果表明只有蛋白质组分子亚型与患者的总体生存期有显著相关性（HR=3.87， P=0.01）。同时，在多因素Cox分析结果中，蛋白质组分子亚型S-III独立于其他临床特征，与患者的不良预后具有显著相关性（HR=3.44， P=0.042）。在外部数据集中，蛋白质组分子亚型S-III不论在单因素Cox分析还是在多因素Cox分析结果中，都与患者的不良预后具有显著的相关性，且明显优于目前临床常用的血清AFP指标（附表2）。综上所述，本研究证明了蛋白质组分子分型具有极好的生存预后相关性，特别是S-III型的特征，展现出了比已知临床特征更强的死亡风险预测和肿瘤复发预测能力，将有望融入临床病理分期系统中，改善肝细胞癌的病理分层系统，实现肝细胞癌的精准医疗。

通过有监督的修正t检验统计分析，本研究共鉴定到1 269个蛋白质组分子亚型特异性表达的蛋白质。通过通路富集分析，研究发现肝细胞代谢功能相关的信号通路，如过氧化物酶体，氨基酸代谢通路，脂肪酸代谢通路，胆汁酸代谢通路和肝脏解毒信号通路等，在S-I型中的表达水平显著高于S-II和S-III型，提示S-I型保留了部分肝脏细胞的基本功能，因此将其定义为“肝功能保留亚型”。细胞增殖相关信号通路，如HDAC信号通路，E2F靶基因，MYC靶基因和细胞周期信号通路，则主要在S-II和S-III型中上调表达，表明此类病人的肿瘤细胞存在恶性增殖的特性。除增殖特征外，S-III型还具有过度的免疫应答反应特征，主要包括补体系统活化，干扰素伽玛反应，FCGR介导的吞噬作用，白细胞迁移，CXCR4信号通路，T-细胞受体信号通路和B细胞受体信号通路等；和肿瘤转移相关信号通路，主要包括HIF1A信号通路，低氧诱导信号通路，细胞骨架重构通路，整合素通路，上皮细胞向间质细胞转化的信号通路等过度激活现象。综上所述，S-I型肝细胞癌保留了部分肝脏细胞的生物学功能，且无肿瘤细胞增殖、转移等恶性转化特质，因此本研究认为针对S-I型病人，术后应避免过度治疗；S-II型肝细胞癌肝细胞功能丢失，而细胞增殖功能加强，建议术后辅以抑增殖治疗；S-III型肝细胞癌其蛋白质分子特征极为复杂，且具有复杂的肿瘤微环境，建议术后进行针对性的靶向药物干预治疗。基于此，找到S-III型肿瘤的潜在药物靶标，将对此类病人的诊治具有重要价值。

S-III亚型的肝癌患者术后预后较差，且具有极其复杂的肿瘤微环境和分子特征。首先，本研究发现在S-III肝细胞癌中，糖酵解途径中的关键调控蛋白显著上调表达，主要包括限速酶（HK1，HK2，PFKP和PKM2），乳酸脱氢酶（LDHA和LDHB）和运载蛋白（GLUT3和MCT4）等。除蛋白质的丰度变化外，PFKP pS386，PKM2 pS37和MCT4 pS436等蛋白质的磷酸化水平也在S-III型中显著上调。其次，胆固醇代谢的关键蛋白，如LDLR，NPC1和SOAT1等，在S-III型明显上调表达，预示胆固醇代谢通路在S-III型中异常激活。另外，促进肿瘤细胞侵袭转移的TGFβ信号通路的关键蛋白，如TGFβ1，TGFBR1和TGFBR2等，在S-III型中显著上调，Rho GTPases信号通路和整合素信号通路也是S-III型肿瘤发生恶化和转移的重要特征。

在早期肝细胞癌中，本研究基于蛋白质组数据分析也鉴定到一类免疫分子亚群（40/101），其特异性的富集Sia等和Yoshihara等提出的免疫分子特征，30例在S-III型，10例在S-I型中。其中，有18例患者明显富集免疫抑制型细胞类型，如调节性T细胞（Tregs）、免疫抑制型-T细胞和M2-巨噬细胞等，我们定义其为“免疫抑制型”亚型。有趣的是，18例“免疫抑制型”患者均来自于S-III型恶性早期肝细胞癌，表明S-Ⅲ患者具有免疫抑制的特性。相对应的，大量抑制型免疫细胞的分子特征，如PD-1、CTLA4、LRRC32、TGFB1、TLR2、MSR1和CSF1R等，在S-Ⅲ型中明显上调。鉴于大量抑制型免疫细胞分子特性在S-Ⅲ型显著富集，我们认为目前流行的免疫疗法可能比较适用于S-Ⅲ患者，如PD-1抑制剂等。同时，以上鉴定的S-Ⅲ免疫特征蛋白，也可作为S-III型患者潜在治疗靶点。

S-Ⅲ亚型的肝癌患者表现出明显的不良预后，靶向该亚型的精准治疗有可能大幅提升早期肝癌患者的预后。为此，我们重点关注了被现有FDA批准药物或目前处于临床验证阶段的药物靶点蛋白。其中在S-Ⅲ型高表达的蛋白质，包括增殖类蛋白质（HDAC2、CDK1、CDK2、GPC3和CSNK1D），代谢类蛋白（ALDH18A1，PKM，MCT4，NPC1和SOAT1），肿瘤转移相关蛋白质（SRC，PLOD2，PH4A2，VCAN，ITGA4，MMP9，MMP14和TGFB1）和免疫治疗靶标（ALOX5，TLR2和CSF1R）。随后，我们应用Cox风险回归分析统计了这些蛋白质的死亡风险指数。如图4d所示，很多常见的药物治疗靶点，如TGFB1、HDAC2、CDK1和MMP9等，在早期肝细胞癌的预后中表现出非常高的死亡风险指数。值得注意的是，在这些药物靶向蛋白中，胆固醇稳态调节的关键蛋白质——胆固醇酯化酶（SOAT1），其死亡风险指数最高，表现出了极好的肝细胞癌风险评估能力，这也预示该蛋白可能进一步通过临床验证，成为新的恶性肝细胞癌的治疗靶点。

入组的101例肝癌患者的蛋白质组数据可知，SOAT1在肿瘤中的丰度显著高于癌旁组织。基于独立人群的254例肝癌样本组织芯片的免疫组化结果也表现出同样的趋势。SOAT1是催化胞内胆固醇酯形成的关键酶，与肝癌组织中SOAT1高表达一致的是，三种常见的胆固醇酯（CE18∶1，16∶0和20∶2）在肝癌中的浓度也显著高于其配对的癌旁组织（N=25）。除了SOAT1，还有其他6个与胞内胆固醇稳态相关的关键节点蛋白在肝癌组织中显著上调，包括负责胞外胆固醇摄取的LDLR，胞内胆固醇转运的NPC1，转录调控相关的SCAP和SREBF2，胆固醇合成的关键酶HMGCR和胆固醇分解代谢的关键酶CYP7A1，这表明肝癌发生发展过程中，胞内胆固醇稳态发生了重要改变。

此外，SOAT1的高表达在3个独立人群中均与肝癌患者的较短总生存期密切正相关。人类病理图谱（www.proteinatlas.org/pathology）的数据表明，SOAT1还与多种肿瘤的总生存率显著正相关：甲状腺癌（N=501， P=0.047），头颈癌（N=499， P=0.002），胃癌（N=354， P=0.005），肾癌（N=877， P=0.007）和前列腺癌（N=494， P=0.005）。这与前期文献报道的SOAT1的高丰度提示前列腺癌和胰腺癌的不良预后是一致的。这些结果同时也表明SOAT1高表达是在多种肿瘤普遍存在的一种现象，有望作为这些肿瘤的预后生物标志物和治疗靶点。

为了确证SOAT1在HCC中的作用，我们选择了2种肝癌细胞系（PLC/PRF/5和HepG2），分别用SOAT1的shRNA进行敲低，发现两种细胞系的增殖和迁移潜能均显著被抑制。用SOAT1抑制剂阿伐麦布处理两种细胞系，也可看到相似的抑制效果，同时敲低组和抑制剂处理组的细胞膜胆固醇含量显著降低。与之一致的是，敲低组和抑制剂处理组中，与胆固醇调控、摄入、转运到质膜相关的蛋白质（SREBF2，LDLR，RAB8A和MYO5B）均显著下调。更值得注意的是，多种定位在细胞质膜，且与肿瘤发生发展密切相关的蛋白质，如ITGAV、ITGAL、ITGA6、ITGB4和TGFβR1均显著下调。其中，整合素类蛋白（ITGAV，ITGAL，ITGA6）的功能受质膜胆固醇含量影响已有多篇文献报道。这些结果提示SOAT1的下调，降低细胞质膜的胆固醇含量，进而抑制整合素和TGFβ信号通路发挥抗肿瘤的作用。

利用SOAT1抑制剂处理HCC患者来源的肿瘤异种移植（PDX）模型，观察其对肿瘤的生长的抑制作用。PDX样本根据靶蛋白的丰度表达，分为两组：低SOAT1蛋白表达组（PDX1，PDX2和PDX3）和高SOAT1蛋白表达组（PDX4，PDX5和PDX6）。结果发现SOAT1抑制剂可显著降低PDX4、PDX5和PDX6的肿瘤体积，对PDX1，PDX2和PDX3的肿瘤生长没有明显抑制作用。考虑到SOAT1在S-Ⅲ肝癌中的高表达，SOAT1抑制剂有望为肝癌中较恶的S-Ⅲ亚型提供一种新的辅助药物治疗。

综上，本研究首次描绘了早期肝细胞癌的蛋白质组图谱，并基于蛋白质组图谱对早期肝细胞癌进行了精准的分子分型。蛋白质组分子亚型具有良好的临床相关性，有望在未来肝癌的精准医疗中发挥重要作用。基于蛋白质组学的大规模数据分析，本研究发现了一批新的肝细胞癌早期诊断、预后评估和精准分型的潜在生物标志物和药物治疗靶点，将进一步促进肝癌精准医疗的发展和提升。