肿瘤细胞的PD-L1表达被认为是抗PD-1/PD-L1治疗的优势人群选择的最合理标志物，晚期肺癌多项临床试验结果都支持肿瘤细胞PD-L1阳性表达与其疗效及预后相关。Keynote 024比较了帕博利珠单抗（Pembrolizumab）与含铂双药化疗用于未经治疗的PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数（TPS）大于50%且EGFR及ALK易位野生型的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的一线治疗，发现该人群中免疫治疗患者无进展生存期（progression free survival，PFS）及总生存（overall survival，OS）明显获益。目前，基于Keynote-024研究数据，美国食品和药物管理局（FDA）已经批准PD-L1免疫组化检测作为NSCLC治疗的辅助诊断。此外，PD-L1表达作为标志物的意义在Keynote 042，Keynote189及IMPOWER131，IMPOWER150中确认，结果均表明：免疫治疗一线联合化疗均能显著改善NSCLC患者的PFS，OS，并且在PD-L1表达高患者中获益更好，证实了PD-L1表达水平与疗效的相关。在CheckMate 057研究中肿瘤细胞PD-L1表达阳性的亚组（≥1%、≥5%、≥10%），Nivolumab治疗的OS获益均比多西他赛治疗明显。抗PD-L1药物Atezolizumab和Durvalumab的多项临床试验也证实了免疫治疗获益程度与PD-L1高表达水平明显相关。2019年美国癌症研究协会（AACR）会议也报道了Pembrolizumab治疗晚期SCLC的Ⅱ期研究KEYNOTE-158，SCLC队列中，PFS和OS数据提示PD-L1表达阳性患者更可能获得生存获益。

尽管如此，CheckMate 017、OAK研究发现PD-L1阴性的部分患者也能从免疫治疗中获益。CheckMate 026的研究结果表明：在PD-L1≥5%人群中，Nivolumab一线治疗的中位PFS并不优于标准化疗（4.2个月vs 5.9个月HR=1.15，95%CI 0.91～1.45， P=0.2511），故在Nivolumab一线治疗晚期NSCLC患者时，仅仅PD-L1表达阳性患者并不一定是其疗效获益的优势人群，而Pembrolizumab联合化疗治疗晚期鳞癌的Keynote 407研究中表明在不同PD-L1 TPS情况下均观察到受益，PD-L1<1%、1%～50%和≥50%的HR分别为0.61、0.57和0.64。最近，在Keynote 189 Ⅲ期试验中，观察到PD-L1表达在免疫联合化疗一线治疗NSCLC的应答者中有各个界值水平的富集；然而，随着PD-L1阈值的放宽，PD-L1阳性的预测效果显著降低。

综上所述，可以发现肿瘤细胞PD-L1表达水平作为已批准的免疫治疗辅助生物标志物，仍存在局限性。造成这种现象的原因包括：①PD-L1的表达受多种机制的调控，一方面是癌症相关经典信号通路，如EGFR、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K）等，另一方面其受炎性反应细胞因子的影响，特别是干扰素-γ等，激活肿瘤细胞及免疫微环境中间质细胞PD-L1的表达；②PD-L1可以同时表达于肿瘤细胞和免疫细胞，评估对象可是肿瘤细胞、免疫细胞或两者之和；③PD-L1的表达存在瘤内异质性、活检部位异质性和时间异质性等，2019年美国临床肿瘤学年会（ASCO）报道根据肺癌GEMINI数据库，比较了NSCLC不同时间，不同器官病灶中PD-L1表达情况，结果提示PD-L1水平与活检部位显著相关（ P=0.007）。肾上腺和肝脏活检的PD-L1水平最高，而在骨和脑活检中最低。而在分析免疫治疗疗效时，发现肺或远处转移活检PD-L1水平越高（1%或50%为界值），ORR越高，PFS和OS越长。但淋巴结活检中PD-L1的表达与该组患者的反应或生存率均无关。④不同检测PD-L1表达的抗体、平台和不同评估体系都有其不同的阳性临界值，难以形成一致的标准去衡量肿瘤细胞PD-L1的表达，蓝印计划的研究结果显示：检测PD-L1表达的抗体22C3、28-8、SP263在检测率上有高度的一致性，三者是否互相通用，目前仍未达成一致意见，而sp142染色阳性肿瘤细胞比其他3种抗体少，目前仅22C3被FDA批准为Pembrolizumab的伴随诊断适应证。因此，PD-L1的表达是一个具有一定意义但仍不完美的标志物。

肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）是指肿瘤基因组中去除胚系突变后的体细胞突变的数目，基因水平变异的负荷可能导致更多突变对应肽段表达，产生新抗原供免疫系统识别。TMB目前主要的检测方式就是应用全外显子测序（WES）或二代测序（NGS）高通量检测血液或者肿瘤组织。在抗PD-1/PD-L1药物治疗肺癌的多项研究都表明TMB与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICIs）疗效相关。Keynote 001研究显示Pembrolizumab在PD-L1未选择人群中，79%的高TMB的患者（>200个非同义突变）具有持久临床获益；而Nivolumab一线治疗PD-L1阳性（≥1%）的晚期NSCLC的Ⅲ期临床试验（CheckMate 026）结果也显示高TMB的患者免疫治疗的PFS获益，然而在OS中，两组之间没有观察到显著性差异。POPLAR研究分析了血液肿瘤突变负荷（blood tumor mutation burden，bTMB）与临床获益的关系，在bTMB≥10、≥16和≥20时均可见接受Atezolizumab组PFS和OS获益显著优于多西他赛，但在bTMB≥16时获益最大（PFS HR=0.57，OS HR=0.56），后在OAK、BFAST研究中选取bTMB≥16为界值进一步验证了高bTMB与Atezolizumab治疗的生存获益相关：bTMB≥16与<16相比，PFS明显获益。OAK研究对组织和血浆TMB检测进行相关性分析，结果显示两者的相关性较好（相关系数为0.59，阳性一致性为64%，阴性一致性为88%）。因此，FDA批准血检TMB作为Atezolizumab一线治疗NSCLC的伴随诊断适应证。免疫联合免疫治疗方面，2019年ASCO报道了一线治疗的MYSTIC研究标志物分析的结果，发现仅bTMB不能预测Durvalumab单药疗效OS差异，而在Durvalumab联合Tremelimumab组各个cut-off值高bTMB均可预测OS获益，然而交互作用检验结果在bTMB分层亚组中未见差异。现阶段抗CTLA-4药物治疗在NSCLC中的应用主要是与化疗或PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗，CheckMate 227关于标志物的分析结果显示Ipililumab联合Nivolumab对比一线化疗治疗晚期NSCLC，高TMB患者联合治疗的PFS得到明显改善，预示着TMB可能为此种免疫联合免疫治疗模式下一个独立预测的生物标志物。

由于肿瘤的异质性，不同获取样本的时间、临界值和检测方法（WES或NGS大panel测序）和成本等影响因素，在国内目前肿瘤突变负荷可能仍是一个参考的生物标志物，在何种治疗模式下应用为辅助诊断仍需更大的努力去探索。

肿瘤新生抗原负荷（tumor neoantigen burden，TNB）是基因组与肿瘤免疫治疗结合点，免疫治疗疗效敏感的多种生物标志物如TMB、微卫星不稳定（MSI）等最终都能归结到TNB。肿瘤新生抗原是指肿瘤体细胞突变编码的特异性表达肽段，通过主要组织相容性复合体-I（MHC-Ⅰ）类分子呈递而被T细胞受体（TCR）特异性识别激活自身抗肿瘤免疫的一类抗原。有研究表明，对Pembrolizumab有持续获益的NSCLC患者TNB的水平明显高于无持续响应的患者，TNB高的患者的PFS显著延长，中位PFS为14.3个月vs 3.5个。但是目前新生抗原的检测识别大多基于生物信息学算法的预测，因此面临的问题是基于算法的筛选和验证标准不统一等。

免疫治疗发挥作用时需要肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的参与，故TIL的丰度也可以作为预测免疫治疗疗效的标志物，目前通常使用免疫组化评估肿瘤组织CD8+T细胞的浸润情况来实现的。有研究发现CD8+T淋巴细胞的数量是NSCLC患者免疫治疗的独立预后因素。在Pembrolizumab的Ⅰ期临床试验（Keynote 001）中发现治疗有效的患者基线活检标本肿瘤实质和边缘中CD8+T淋巴细胞数量高于进展的患者。而CD28作为一种共刺激因子信号也能预示治疗疗效，TIL细胞中CD28+的比例越高，治疗得到响应的可能性越大。因此TIL与免疫治疗疗效是有一定关联的。

FDA在2017年批准Pembrolizumab治疗前治疗进展、无其他标准治疗选项的微卫星高度不稳定性（MSI-H）或DNA错配修复缺陷型（dMMR）实体瘤，这是首个按照肿瘤标志物审批的泛肿瘤适应证。但MSI-H在肺癌中的发生率很低，约为0.4%～0.8%，MSI-H/dMMR对肺癌免疫治疗疗效的预测价值有待更多数据的支持。

POLD1、POLE、PBRM1失活突变、DNA损伤修复（DDR）通路编码DNA复制过程中的具有校正和修复功能的蛋白，发生突变后会引起非同义突变负荷和TIL数量的升高。而王洁教授团队关于DDR通路共突变的研究结果提示，DDR通路基因发生共突变与TMB显著相关，可作为潜在的预测免疫治疗疗效的分子标志物。该标志物不仅能够从PD-L1低表达或低TMB人群中筛选出潜在获益人群，且不需要设定临床界值，仅通过“阳性与否”即可判断TMB-H及免疫治疗疗效。

有研究发现TP53或KRAS基因同时突变时PD-L1的表达会更高，TMB也往往是高的，Pembrolizumab治疗的临床获益往往较好。Atezolizumab的BIRCH研究中一线治疗的KRAS突变亚组分析发现突变型的疗效要优于野生型，PFS分别为9.8月vs 7.1月，OS分别为31.9月vs 21.3月。Skoulidis等评估肺腺癌中KRAS合并其他突变对免疫治疗疗效影响的研究，发现KRAS合并TP53突变的有效率最高，KRAS合并STK11/LKB1型的有效率最差，仅KRAS突变者居中，三组的ORR分别为35.7%，7.4%，28.6%（ P=0.000 73），中位OS分别为16.0月vs6.4月vs 16.1月（ P=0.001 8），KRAS联合TP53突变的临床疗效较好，研究也提示了STK11/LKB1突变患者的原发耐药特征，说明了基因检测在免疫治疗前的重要性。

弥补PD-L1作为独立预测因子不足的可行策略或许是联合其他标志物，已有许多证据表明PD-L1表达和TMB是相互独立的指标。CheckMate 026特别将TMB和PD-L1表达联合进行分析，发现高TMB同时PD-L1表达≥50%的人群患者疗效获益更多，Nivolumab组的ORR为75%。而在POPLAR研究中bTMB≥16与肿瘤细胞PD-L1表达≥50%之间只有有限的重叠（ P=0.62），两者分别互占19.2%和29.1%的比例，与疗效的分析显示bTMB≥16且PD-L1 TPS≥50%或间质细胞（IC）≥10%的患者从Atezolizumab治疗中获益最大。CheckMate 227的结果也显示：在TMB≥10 mut/Mb人群中，PD-L1 ≥ 1%的生存优于PD-L1 <1%。2019年ASCO报道了一项对比Nivolumab联合Ipilimumab和Nivolumab单药的Ⅲ期研究，对TMB和PD-L1联合分组显示（分4组，以TMB=10，PD-L1表达5%为界值），TMB和PD-L1均高表达者，Nivolukmab单药或双免疫治疗OS最长。另外一项真实世界研究回顾性分析426例NSCLC患者，揭示高TMB且高PD-L1预测可以得到最高真实世界肿瘤缓解。

最近，关于PD-L1联合CD8+TIL对免疫治疗的预测价值的探讨和研究逐渐增多，一研究基于四分法评估PD-L1联合CD8+T淋巴细胞对Ⅲ期NSCLC的预后预测作用，结果表明CD8+TIL高同时PD-L1表达阳性的患者生存最好。在另外一项晚期NSCLC的研究中，CD8+ TIL与PD-L1联合预测价值比单一标志物更好。故PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞的联合对ICIs的联合预测有一定价值。

在CheckMate 057、Keynote 010、Keynote 024的亚组分析中都发现相比标准化疗，吸烟者较不吸烟人群抗PD-1/PD-L1治疗后获益更多，Meta分析也证实了这一点。相关研究表明应用WES或者聚合酶链式反应（PCR）方法检测胚系人类白细胞抗原-I（HLA-I）类多样性可以预测NSCLC免疫治疗的疗效。Tumeh等发现参与肿瘤特异性免疫反应的T细胞受体簇与Pembrolizumab治疗疗效有一定关系，相比进展组，治疗有效者在抗PD-1治疗后T细胞受体克隆较治疗前增长。

肠道菌群的组成及多样性是近年来许多领域的研究热点，研究发现其与ICIs的临床疗效也密切相关。Routy等的研究纳入了249例非小细胞肺癌、肾癌和膀胱癌的患者，发现应用抗生素的患者免疫治疗的疗效显著更差（mOS，11.5个月vs 20.6个月），另外患者粪便阿克曼菌的丰度与治疗响应有关。且目前肠道菌群的研究还停留在基础和观察性队列研究。

基于外周血中相关细胞及代谢分子检测对ICIs疗效的影响也引起广泛关注，这可能也是目前报道的最“经济”的标志物。众多临床研究提示乳酸脱氢酶（LDH）水平越高、血白蛋白越低、中性粒细胞与淋巴细胞比（NLR）越高，ICIs的疗效越差。2019年ASCO报道了一项来自意大利单中心回顾性研究纳入了使用Pembrolizumab或Nivolvmab的NSCLC 71例，结果表明：NLR，PLR和LDH水平的基线评估与NSCLC ICI单药治疗的结局显著相关，治疗12周时LDH水平的动态变化可预测临床结局。如果未来通过前瞻性队列的建模及验证，这些容易获得的临床参数可能在筛选获益患者中有广泛用途。

一项meta分析纳入了二线抗PD-1/PD-L1药物对比多西他赛治疗晚期非小细胞肺癌的疗效与安全性的3项临床试验（CheckMate 057/KeyNote 010/POPLAR），发现EGFR阳性人群多西他赛组的疗效优于免疫治疗组。并且Atezolizumab一线治疗的BIRCH研究和二线治疗的OAK研究中的EGFR突变亚组分析也发现EGFR突变型患者似乎不能从免疫治疗获益。有证据表明EGFR通路的激活会上调免疫微环境中PD-L1和其他免疫抑制因子的表达，使肿瘤抗原的表达和T细胞对肿瘤的浸润减少。回顾性研究数据提示，在不同驱动基因的肺癌人群中KRAS基因突变的ORR最高为26%，BRAF为24%，ROS1为17%，MET基因为16%，EGFR为12%，HER2为7%，RET为6%，ALK仅为0。但另一方面，IMpower150研究纳入了标准靶向治疗失败的EGFR突变或ALK重排的患者，亚组数据表明四药联合方案（双药化疗联合抗血管生成治疗及Atezolizumab）相比其他组的PFS和OS都有改善。所以对有可靶向的驱动突变（EGFR、ALK等）的患者，靶向治疗仍是首选。目前数据提示单药免疫治疗不获益，而耐药后或许免疫联合化疗及抗血管治疗可以成为潜在选择。

STK11突变也显示出对NSCLC患者免疫微环境的影响，与PD-L1染色阴性和低水平CD8 TIL的相关。2019ASCO一项回顾性研究纳入欧美17个机构497例非鳞转移性NSCLC（mnsNSCLC）患者，患者有可供基因检测（含STK11/LKB1）的肿瘤组织。接受Pembrolizumab联合铂类+培美曲塞（CPP）方案治疗的患者中，与野生型相比STK11/LKB1突变的患者PFS更短（m PFS 4.8月vs 7.2月， P=0.006 3），OS更短（mOS 10.6月vs 16.7月， P=0.008 3）。限定性分析EGFR及ALK野生型患者也得到相似结果。更重要的是，对于STK11/LKB1基因突变的mnsNSCLC，CCP联合方案与单纯CP相比，并不能提高PFS或OS。这是STK11突变与免疫治疗不获益相关的真实世界数据证据。而基于一项纳入78例非小细胞肺癌患者的真实数据研究发现，肿瘤抑癌基因（TSG）如ITGA9，TIL衍生的干扰素-γ（IFN-γ）通路基因如JAK2基因，IFNE基因，以及免疫相关趋化因子受体（CCR）通路等基因的拷贝数缺失都与PD-（L）1治疗效果负相关；并且从染色体水平上看，特定染色体3p片段缺失与PD-（L）1治疗效果也呈负相关，而很多抑癌基因及CCR通路基因都在染色体3p上。

临床前研究证明B2M（HLA一类复合体的保守亚基）的失活突变会导致有三分之一的NSCLC的HLA-1复合体低于可检测水平，这一现象也与肿瘤的低PD-L1表达和低TIL相关。而这样的失活突变在验证队列中大致的发生率为10%。其他较低频率的参与HLA-I复合物成熟过程的分子（如CALR、HLA-A、PDIA3或TAP1）的基因改变也有报道。另有报道称一些癌基因和抑癌基因比如抑癌基因PTEN缺失会增加肿瘤免疫抑制因子的表达，使PD-1抑制剂有效率降低，这一结论在一项PD-1抑制剂的黑色素瘤研究中得到证实。

超进展（hyperprogressive disease，HPD）在免疫治疗逐渐应用后越来越引起人们的重视。其被定义为肿瘤反常的加速生长，包括在免疫检查点抑制剂治疗后第一次评价时进展，至治疗失败时间（TTF）短于2月，肿瘤体积增加大于50%并且肿瘤增长速度（TGR）增加大于2倍。2018年Roberto Ferrara等在JAMA Oncology发布研究数据，406例接受PD1/PD-L1抑制剂治疗的晚期NSCLC患者，超进展的发生率为13.8%。而超进展与患者的更差的OS密切相关，Champiat等基于泛癌种的研究表明免疫治疗导致的HPD与基线肿瘤负荷、肿瘤组织学类型、既往治疗线数、预后评分、PD-L1表达水平无相关性；HPD与高龄（>65岁）、较差OS密切相关。

从基因组的角度看，目前有研究证明MDM2/MDM4基因扩增和EGFR基因突变可能是潜在预测HPD的标志物。在一项包含肺癌的多癌种研究里接受PD-1/PD-L1单药的人群6例MDM2/4扩增患者TTF均小于2月，其中4例发生超进展；10例EGFR扩增或激活突变患者中有8例TTF小于2个月，2人发生超进展；以及5例DNMT3A突变的肿瘤患者，有4例在2月内发生进展。此外，2017年ESMO年会上，法国学者Singavi的报道则纳入了5例HPD患者，其中非小细胞肺癌、食道癌2例，肾癌1例。NGS分析后认为EGFR，MDM2/MDM4扩增和位于11q13位点的一些基因如CCND1、FGF3、FGF4和FGF19等扩增与HPD存在相关性，这些基因变异可能是预测HPD的标志物。

由于免疫检查点抑制剂应用于临床的时间尚短，导致目前获得性耐药的分子机制尚未十分清晰明了。已知与原发耐药相关的机制部分也介导获得性耐药，例如B2M基因的失活突变和纯合性缺失可能导致HLA抗原表达缺陷，这种B2M的变异也在黑色素瘤和结肠癌免疫检查点抑制剂的获得性耐药案例中被报道。类似的肿瘤抗原表达缺陷机制可受到多种方式影响，如编码抗原的突变区域发生拷贝数变异导致新抗原丢失，也是ICIs获得性耐药的机制，在包括肺癌的多种肿瘤类型中报道。干扰素信号通路成员基因如JAK1/2的功能失活突变，已确定为黑色素瘤ICI治疗耐药的机制。然而，NSCLC患者中的获得性耐药机制往往是与适应性免疫标记的增加和T细胞激活和监视相关，其机制独立于抗原丢失。另外一些在原发耐药中观察到的肿瘤细胞内在信号通路，也可能与获得性耐药相关，包括PD-L1上调，PTEN的缺失，STK11/LKB1的失活突变，c-Myc的激活，WNT/β-catenin通路的激活，和染色质调节子，PBAF等。

免疫治疗重塑了目前肺癌领域的治疗模式，筛选获益人群是目前肺癌免疫治疗面临的最大挑战。横贯在这一挑战面前的，除了现有单一标志物的局限性，还有肿瘤随时间空间的异质性。基于肿瘤异质性和免疫微环境中多种免疫因素的协同存在，多组学多角度的指标结合或许在筛选优势人群上更为合理。而对肿瘤微环境的动态评估受限于组织的获取，基于常规的临床实验室检测、循环肿瘤细胞（CTC）或者循环肿瘤DNA（ctDNA）等的动态液体活检是未来可以探索方向。另一方面，对于那些未被筛选、潜在耐药、携带负向标志物的患者，可能需要探索免疫联合治疗、或其他广义的免疫治疗的策略。根据目前数据来看，不同靶点、结构的ICIs也体现出了各自的特异性优势人群标志物特点，因此目前的临床应用仍需严格参照现有的循证医学证据充足的特定标志物来筛选特定药物的获益人群。而随着我国自主研发的ICIs的证据积累，基于各药物的标志物探索工作也需要完善。总之，针对肿瘤与免疫微环境之间的相互作用，动态检测两者之间的变化的探索，并深入了解肿瘤免疫及其对治疗疗效的影响，仍是目前及未来重要的研究方向。