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第六节 无菌动物和悉生动物技术
普通动物是在开放系统条件下饲养的，均受到自然界微生物和寄生虫的侵袭，一般都带细菌、病毒和寄生虫。有的动物外观看起来健康，其实都隐藏着某些疾病或有微生物与寄生虫的感染。因此用普通动物进行实验和研究，将会存在各种各样的干扰，实验结果往往不确切。要提高动物实验的准确性，就必须对实验动物在遗传和微生物两个方面加以控制，培养出标准的合格动物，才能使实验结果正确可靠，达到反应均一性和重复性。采用兄妹间近亲交配繁殖20代以上所培育的近交系动物，遗传均一、个体差异小、实验结果比较准确。但是只从遗传上加以控制，如不进行微生物控制，没有排除自然感染的微生物和寄生虫的影响，实验结果仍可能不准确。因此，在精度要求高的实验中，无菌动物、悉生动物和无特殊病原体动物就成了理想的实验动物。
由于微生态学研究的主要内容之一是正常微生物群对宿主的影响，因此无菌动物和悉生动物技术自然就成为微生态学研究的极好手段。无菌动物和悉生动物为研究正常菌群对宿主的生物拮抗、营养代谢和免疫作用提供了极为重要的方法。通过比较无菌动物、悉生动物和普通动物或定植人粪便菌群的无菌动物如人粪便化小鼠（humanized-mice），可以确定特定菌群的作用。
一、无菌动物和悉生动物的基本概念
按对微生物的控制的程度，可以将实验动物分为四类：①无菌动物（germ free，GF）；②悉生动物或已知菌动物（gnotobiotics，GN）；③无特定病原体动物（specific pathogen free，SPF）；④普通动物（conventional，CV）。无菌（germ free）动物是在无菌屏障系统中，剖腹取出胎儿，饲养繁育在无菌隔离器中，饲料、饮水经过消毒，定期检验，证明动物体内外均无一切微生物和寄生虫（包括大部分病毒）的动物。无菌动物的“菌”主要是指细菌，而严格来说，还包括真菌、立克次体、支原体和病毒等微生物及各种寄生虫。而所谓“无菌”不是绝对的，不过是根据现有的科学知识和检查方法在一定时期内不能检出已知的微生物和寄生虫而已。
用大量抗生素也可以使普通动物暂时无菌，但是这种动物不是无菌动物。因为这种无菌状态往往是一过性的，某些残存的细菌在适当的条件下又会在体内增殖；即使能把体内细菌全部杀死，它们给动物造成的影响却是无法消除的，例如：特异性抗体的存在、网状内皮肤系统的活化、某些组织或器官的病理变化等。因此，无菌动物必须是生来就无菌的。
悉生动物（gnotobiotic animals）也称已知菌动物或已知菌丛动物（anima with known bacterial flora），是指用与无菌动物相同的方法取得饲养（剖腹取胎，在隔离器内饲养）、并明确体内给予了已知微生物的动物，即凡含有已知的单菌（monoxenie）、双菌（dixenie）、三菌（trixenie）或多菌（polyxenie）的动物。一般是将1～3种已知的微生物人工接种于无菌动物体内定居，无菌动物接种一种已知菌就是单菌动物，以此类推。由于此种动物和无菌动物一样是放在无菌隔离器内饲养的，因此选用此种动物做实验准确性是很高的，可排除动物体内带有的各种不明确的微生物对实验结果的干扰，常用于研究微生物和宿主动物之间的关系，并可按研究目的来选择某种微生物。
悉生动物是特定的微生物定居于无菌动物的动物，可以说是一种动物与微生物的复合体，也饲养于隔离器中，饲养方法与无菌动物相同。由于这种动物是有菌的，所以隔离器内也有这种微生物的存在。
二、无菌动物的特征
只要饲料配备适当，无菌动物发育正常，外观和普通动物相同，但是其功能、结构和普通动物有很大的不同。无菌动物受两个因素影响，即微生物和因饲养比较聚集而致的肾上腺增大。无菌动物的特征主要反映在下面两个方面：
（一） 形态学改变
1. 消化系统
主要变化在肠道。
（1） 无菌动物肠道肌层薄，更为特异的是盲肠肥大，比普通动物要大5～6倍。无菌豚鼠的盲肠可达体重的1/3。主要是由于肠壁薄、张力低而增大。由于盲肠膨大，肠壁菲薄，常因盲肠扭转或肠壁破裂而死亡。如给无菌动物注入梭状芽孢杆菌则可缩小盲肠体积。
（2） 肠黏膜绒毛增多。
（3） 肝脏重量下降。
2. 循环系统
心脏相对缩小。
3. 血液系统
白细胞增加。普通动物白细胞总数波动范围大，无菌动物白细胞数值恒定。
4. 单核-巨噬细胞系统
脾脏缩小，无三级滤泡，单核-巨噬细胞功能降低。
（二） 生理学改变
1. 免疫功能
由于单核-巨噬细胞系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生丙种球蛋白的能力很弱（在检查无菌动物的无菌性时，血清丙种球蛋白阴性可以作为无菌的一个辅助证据），又因为体内无微生物和寄生虫，血中无抗体，血清杀菌力低，吞噬细胞噬菌力也低，因此对微生物感染异常敏感，某些病原性弱和必须经腹腔或颅脑接种才能感染普通动物的微生物很容易感染无菌动物。
2. 生长率
无菌条件下对不同种属影响不同。无菌鸟类生长率高于同种的普通鸟类；无菌大小鼠与普通鼠差不多；无菌豚鼠和无菌兔生长率比普通者慢。这是因为因肠内无菌，不能帮助消化纤维素以提供机体所需要的营养。
3. 生殖
无菌条件对动物的生殖影响不大。无菌大鼠和小鼠的繁殖率高于普通动物；无菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因大盲肠之故。
4. 代谢
血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长。
5. 营养
无菌动物肠道上皮细胞更新率比一般动物低，肠壁的物质交换也较慢。无菌条件下的各种动物通过胆汁排泄代谢产物的速率均减慢；如切除无菌动物的盲肠，则无菌动物与普通动物的差异缩小。关于盲肠增大的原因，曾进行过许多研究，尚无明确结果。推测可能是因为饲料中的有毒物质刺激盲肠，使其增大加长、弹性减少。正常情况下饲料中的毒性物质可被肠道菌分解。无菌条件对兔及豚鼠的盲肠产生的影响最大，Sabourdy曾称量过无菌豚鼠的盲肠（连同肠内容物），结果盲肠相当于豚鼠体重的1/3。
6. 寿命
无菌大鼠和小鼠比普通者长寿。
三、无菌动物技术
无菌动物在自然界并不存在，必须用人为的方法养育而成。无菌动物的理论基础和实践依据在于胎盘屏障和屏障观念。实施过程有以下几个环节：
1. 在无菌条件下取仔
培育胎生动物如哺乳类，要用无菌的剖宫产手术，将已成熟的胎儿从无菌的子宫内取出，通过灭菌液浸泡槽输入无菌隔离器内，用人工配制的初乳饲喂。培育无菌卵生动物，如禽类，要从微生物传染病最少的健康动物群中，选择未被粪便污染的受过精的蛋，并将蛋的表面彻底灭菌后送入无菌隔离器内孵化育雏。
2. 无菌动物的饲料和饲育装置
饲养无菌动物的环境必须是绝对没有微生物以及其他可能感染动物的生物。根据这个要求，美国赖尼瑟在1943年用金属材料制成能耐受高压蒸气灭菌的隔离器，隔离器上有玻璃观察窗和操作橡皮手套，他用这种隔离器饲养出了无菌鸡。1959年特雷克斯勒使用无毒塑料薄膜制成无菌隔离器的主体部分。这种隔离器制造工艺较为简单，易于观察操作，造价仅为金属制的几十分之一，灭菌简便。
人工乳的营养成分和饲喂技术，是无菌动物饲养成功的关键。离乳后喂给灭菌的饲料和饮水。输入无菌隔离器的空气要经过0.3微米的滤除率达99.97%以上的高效滤过器，排气口亦同样装有高效滤过器，以免空气逆流时带入细菌。饲料、饮水和垫料都要经过真空高压或钴60照射灭菌后输入器内。
3. 无菌动物的检查
对无菌动物要定期检查，以确保无菌状态。一般每两周检查一次，发现污染立即淘汰。
四、悉生动物的饲养管理
悉生动物和无菌动物一样，均饲养在无菌隔离器中，饲养管理方法也与无菌动物相同。无菌动物由于肠道里没有细菌，所以不能在肠内合成机体所需要的某些维生素和氨基酸，而必须由日常的饲料中补给。无菌动物饲养管理困难，且生活能力较差。把对机体有益的若干种肠道细菌喂给无菌动物，使之在肠道内定居，这就成为悉生动物。它远较无菌动物的生活能力强。饲养管理也比较容易，在多种研究试验中，可以代替无菌动物。
悉生生物因为无微生物的刺激，其淋巴系统发育不全，体液和细胞防御系统不如普通动物；淋巴浆细胞少，脾较小，白细胞缺乏和吞噬反应差，血清杀菌活性差，球蛋白含量低，很少含有抗细菌的凝集素，因而无菌动物易于感染疾病。
【小结】
常规涂片及培养技术是研究细菌的传统方法，其中厌氧培养技术对正常菌群的研究尤其重要。分子生物学技术如核酸扩增、电泳、探针杂交等成为目前研究正常菌群的主要手段之一，应用16S rRNA作为研究对象，采用以PCR为基础的多种分子生物学分析手段的联合应用，可以快速、微量、准确地对正常微生物进行检测，不仅可以对肠道细菌组成及数量进行测定，还能对细菌的活性进行分析。宏基因组技术是以测序为基础的研究微生物所有基因（基因组）的方法，主要的研究手段是第二代高通量测序和生物信息分析，宏基因组学技术在正常菌群的研究方面具有独特的优势，目前已经取得了一些突破性的结果。菌群代谢产物检测技术有许多种方法，采用何种技术主要取决于待分析物的种类以及研究的目的。代谢组学则是通过以上各种技术定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量，从而为更直接地揭示正常菌群与人体健康和疾病的关系提供了新的途径。无菌动物与悉生动物为我们研究正常菌群对宿主的影响提供了非常好的模型，能够使我们更加全面地宏观地研究正常菌群对宿主的生理作用。
（马卓娅 郑跃杰）