应用于临床的遗传学检测方法多种多样，根据不同的检测目的，需要选用相应的组织标本。如检测肿瘤的体系突变基因，则应选用肿瘤组织；如果是检测胚系突变，则需要有如血细胞或癌周正常组织作为对照；如果要确定水泡状胎块的性质，则还需要提取配偶细胞样本。组织或细胞标本不能直接用于检测，根据需要，应提取DNA、RNA或蛋白质等大分子进行检测。检测方法对组织要求是不同的，对于极不稳定的RNA，新鲜的标本是最优选择，而DNA或蛋白则可以采用10%的溶液固定的石蜡包埋（Formalin fixed and paraffin embedded，FFPE）标本。然而，对于临床检测，最多的限制是样本的来源，临床上往往FFPE标本是仅有的选择。这时，只能通过优化提取方法，最大限度地利用现有的材料。

血样本用于检测胚系的突变、淋巴造血系统肿瘤。血样本用一次性抗凝采集管采集，推荐使用EDTA抗凝管（紫色盖），柠檬酸抗凝管（橙色盖）也可以使用。最好不要用肝素抗凝管（绿色盖），因为肝素会对后续的PCR反应有抑制作用。2～5ml可以满足大多数检测的需要，如果检测循环肿瘤细胞，则需要10ml抗凝血。血样在常温下保存24小时，2～8℃可延长至72小时。而用梯度离心得到的白细胞悬液可以在-20℃保存1年。短途转运可在常温下进行。白细胞需要采用Ficoll梯度离心液去除红细胞，而不能用细胞裂解液裂解红细胞，因为血红蛋白会影响PCR反应 ^［1］。

新鲜组织是各种检测最理想的样本。需要在无菌的环境下用细胞冻存管收集，组织离体的时间需控制在30分钟以内，取下的标本应立即放置于-80℃或液氮中。5mm×5mm×5mm大小的组织可满足一般的分子生物学检测。如果是肿瘤样本，则组织中肿瘤细胞需要占50%以上。标本转运需要干冰，如果是短途转运，可以用无菌的湿生理盐水纱布覆盖组织以防水分蒸发 ^［1］。

FFPE组织是生物组织最常用的，但也是受影响因素最多的保存方式。因此，标准化的组织处理和严格的实验室记录是遗传检测能否成功的基础。在分子遗传诊断技术日渐普及的今天，非常可能在常规形态学诊断之后进行分子检测，故标本处理标准宜提高至分子诊断所需的水平。如果没有注意到这一点，而导致需要进行分子诊断时因组织标本不符合要求而放弃检测是非常遗憾的。这一系列过程统称为分析前处理（preanalytical treatment，PAT），然而需要知道，PAT的流程非常复杂，目前很多环节的影响因素还停留在经验阶段。PAT包括标本离体至病理检查的时间、取材时间、固定液渗透时间。在固定液渗透入组织后，所有的酶均失去活性，生物分子才能保持相对稳定的状态。研究显示，在手术阻断血液5分钟后，如蛋白磷酸化等调节即发生改变，所以需要及时地固定标本。固定液一般使用10%的中性福尔马林，由于其可以产生DNA和蛋白之间的交联作用而导致DNA的碎片化，固定时间越长，可提取的核酸越少、片段越短。所以固定时间不宜超过24小时，如果需要超过此期限，可以考虑甲醛固定前将标本放置于70%的乙醇溶液中固定，则对组织基本没有影响。脱钙液处理的组织不适用于检测。组织内的RNA最易受到组织内残留水分中的RNA酶的降解，所以脱水过程需要严格去除水分。常温存放蜡块一般认为是可靠的。只要是固定和脱水步骤符合要求，生物大分子在蜡块中的降解速度约5%～50%／10年。一些实验室甚至在存放20年的蜡块中提取出了可以用于检测的RNA（需要在正式切片前修掉表面的组织）。需要注意的是，RNA的降解是片段的两侧向中间逐步降解，故在做反转录为cDNA时，使用polyT引物时可能效率会降低。切片时最大的问题是交叉污染，故切每一例组织时都需要更换新的刀口或刀片以尽量减少前后标本之间的相互污染。一般切取5μm厚度的蜡片，当完整的组织符合检测要求时，可以考虑将5～10张蜡片放置于离心管里，这样做可以避免蜡片接触到水时RNA降解。当检测只针对部分组织进行时，则是需要进行显微切割，此时必须将切片摊于载玻片上（显微切割的步骤见下文）。切好的蜡片需要尽快使用，长期放置会导致各种大分子出现程度不一的降解。如果需要存放一定时间，可以考虑将载有切片的玻片浸于石蜡后保存，另有一些专用的方法，如在氮气或真空下保存，但需要相应的设备。最为简便易行的办法则是放在切片盒中，在阴凉处放置，尽快使用。冷藏并没有太多帮助 ^［1，2］。

细胞样本根据样本的来源分为脱落细胞（宫颈或口腔黏膜）、细针穿刺以及胸、腹水样本。目前商用的细胞保存液均可以用于分子检测，常温下可放置约2周。胸、腹水样本中如果为血性，需要用梯度离心去除红细胞 ^［1］。

如果肿瘤在组织标本中所占的比例较小，为防止非肿瘤细胞影响检测结果，需要用显微切割的方法相对精确地将肿瘤部分提取出来。显微切割可以采用激光显微切割仪，根据不同品牌的仪器选用相应的耗材和流程，但费用较为昂贵。人工显微切割的精度可以满足大多数的分子生物学的检测，且仅需要一台普通的光学显微镜或解剖镜、一根30G的无菌注射针头或手术刀柄及无菌手术刀片。切片的来源可以是FFPE组织或冷冻切片，切成5μm的切片，贴于普通的载玻片上。FFPE切片需要用二甲苯和梯度酒精脱去石蜡，冷冻切片则放置于切片机箱中自然干燥。一组切片的第一张和最后一张切片用苏木素-伊红染色，用于确定切割位置。待切割的切片仅用苏木素染色，注意需要在4℃条件下染1～2分钟，再用4℃去离子水返蓝2分钟。吸干水分，-80℃保存。已证实普通的去离子水并不降低RNA的提取效率。切割时，在显微镜下将HE染色的切片相应区域的组织用针头与周围组织划开并挑进1．5ml离心管中-80℃保存 ^［3］。

实体肿瘤在血中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）或循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是监测肿瘤手术切除后是否复发的敏感的方法，有助于对患者及时地进行治疗和分期。分离出的肿瘤细胞也可以用于其他的分子遗传学检测。如何富集血标本中的微量的肿瘤细胞是关键步骤，目前最常用的，也是美国食品药品监督管理局（FDA）通过的 Cell Search捕获仪（Janssen Diagnositics，Raritan，NJ），是基于抗体捕获的原理，即用包被有上皮抗体（如：EpCAM）的磁珠吸附全血中的上皮性肿瘤细胞，再用磁场将这些磁珠吸附于管壁上以去除其他血细胞成分。这些富集的细胞再用免疫荧光的方法标记肿瘤特异性的抗体进行进一步证实，同时可以用血细胞特异标志物CD45染色进行阴性筛选。最终可以通过荧光显微镜计数EpCAM ⁺／CD45 ^-的肿瘤细胞，这些细胞可以用于其他的分子遗传学检测。需要注意，在特定情况下血液中可以出现非肿瘤性的上皮成分，如肠憩室病、Crohn病、溃疡性结肠炎、子宫内膜异位症、良性息肉等。结合肿瘤特异性抗体的筛选和DAPI核染色等形态学的检查，可降低假阳性的风险。

肿瘤患者的外周血中常常游离核酸的含量上升，且肿瘤细胞特定的突变DNA可释放入血，即ctDNA，因此可以通过ctDNA的存在和浓度来监测肿瘤的复发。ctDNA的富集可以使用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen，Hilden，North Rhine-Westphalia，Germany） 手工提取或是使用QIAsymphony SP Circulating DNA Kit全自动提取 ^［1］。

用于胚系突变检测的DNA样品可以选取血标本或唾液标本，但对于接受过输血或骨髓移植的人群，则因为血标本或唾液标本存在供体DNA的污染而受到影响。最为准确的方法是提取患者的成纤维细胞进行体外培养，用培养所得的细胞进行DNA提取，如果在不满足培养条件的实验室，可考虑使用有毛囊的头发作为标本，这一方法被证实不易受供体的干扰 ^［4］。

DNA：5ng的DNA可以满足一般的PCR需求。Qiagen公司的各种类型的试剂盒可以针对血样本、冷冻组织或FFPE组织进行提取和纯化DNA。纯化的方法主要有硅胶颗粒吸附、离子柱吸附等。具体方法（以QIAamp DNA Mini Kit和FFPE Tissue Kit，Qiagen，Hilden，Germany为例）：

（1） 吸取 20μl蛋白酶 K 于 1．5ml离心管中。

（2） 加入200μl的全血或相当于最多5×10 ⁶个细胞（用PBS稀释）的样本。

（3） 加入 200μl的AL缓冲液，振荡15秒，56℃ 孵育10分钟。

（4） 离下管壁的液体后，加入200μl无水乙醇，振荡15秒，再离下管壁的液体。

（5） 将液体加在QIAamp离心柱中央，离心柱套在2ml收集管内，盖好盖子，8 000r／min离心1分钟，弃去收集管，将离心柱放在新的收集管内。

（6） 离心柱上加入500μl AW1缓冲液，8 000r／min离心1分钟，再换新收集管。

（7） 离心柱上加入500μl AW2缓冲液，14 000r／min离心3分钟。

（8） 离心柱置于 1．5ml离心管内，柱上加 AE 缓冲液 200μl，室温放置 1 分钟，8 000r／min离心1分钟即可得到DNA样本。

（1） 将25mg组织恢复室温后切成碎片，放置于1．5ml离心管中，加入180μl ATL缓冲液。

（2） 加入20μl蛋白酶K，振荡15秒，56℃ 孵育，直至组织全部溶解，可以在孵育期间反复多次震荡以加速溶解。

（3） 离下管壁的液体后，加入200μl的AL缓冲液，振荡15秒，70℃ 孵育10分钟。

以下步骤接上述血液样本的步骤4，重复一次第8步。

（1） 切去蜡块上组织边缘多余的石蜡，切取5～10μm厚度的蜡片8张，放入1．5ml离心管中。

（2） 加入 1ml二甲苯，剧烈振荡 10秒，14 000r／min 常温离心 2分钟。

（3） 吸去上清液，加入1ml无水乙醇，振荡10秒，14 000r／min常温离心2分钟。

（4） 吸去上清液，开盖室温放置至少10分钟，直至乙醇全部挥发。

（5） 用180μl ATL缓冲液重悬，加入20μl蛋白酶K，混匀，56℃孵育1小时或直至组织全部溶解。

（6） 90℃孵育 1 小时。

（7） 离下管壁的液体后，加入200μl的AL缓冲液，振荡15秒，加入200μl无水乙醇，再振荡混匀，再离下管壁的液体。

（8） 将液体加在QIAamp MinElute离心柱中央，离心柱套在2ml收集管内，盖好盖子，8 000r／min离心1分钟，弃去收集管，将离心柱放在新的收集管内。

（9） 离心柱上加入 500μl AW1缓冲液，8 000r／min离心 1分钟，再换新收集管。

（10） 离心柱上加入 500μl AW2缓冲液，8 000r／min离心 1分钟，再换新收集管。

（11） 14 000r／min 离心 3 分钟。

（12） 离心柱置于 1．5ml离心管内，柱上加 ATE 缓冲液 20～100μl，室温放置 1分钟，8 000r／min离心1分钟即可得到DNA样本。

RNA的处理需要严格地防止RNA酶的降解。可以在组织匀浆后加入高离液序列的盐如硫氰酸胍，或使用无害的RNAlater（ThermoFisher，Waltham，MA）来保存完整的细胞或组织样本，组织需要切成<5mm的薄片以利于快速渗透，室温下可以保存1周，-20℃可以长期保存。RNA的纯化分为总RNA的提取和mRNA的提取，mRNA一般占总细胞RNA的1%～5%，是最有生物学意义的分子。可以采用Poly（A） Purist试剂盒 （Ambion，Life Technologies）或Oligotex Direct mRNA 试剂盒（Qiagen）等提取。以下步骤以Oligotex Direct mRNA试剂盒为例：

（1） 组织放置于合适的容器内，加入一定比例的OL1缓冲液（OL1使用前要加入β-巯基乙醇）匀浆。

（2） 加入一定比例的ODB缓冲液，用加样枪吸打混匀，14 000r／min离心3分钟，将上清液移入新的无RNase的离心管。

（3） 加入一定比例的Oligotex Suspension，用加样枪吸打混匀，室温放置10分钟，14 000r／min离心5分钟。

（4） 用100μl OL1缓冲液重悬，加入 400μl ODB，70℃孵育 3分钟，室温放置 10分钟。

（5） 14 000r／min 离心 5 分钟，弃上清液。

（6） 用 350μl OL1 缓冲液重悬，加在离心柱上，套在 1．5ml离心管内，14 000r／min 离心 1分钟，弃去收集液。

（7） 离心柱套在新的1．5ml无RNase的离心管内，吸取350μl OW2缓冲液加在离心柱上，14 000r／min离心1分钟，弃去收集液。

（8） 重复步骤（7），不用换收集管。

（9） 离心柱套在新的 1．5ml无 RNase的离心管内，吸取20～100μl OEB 缓冲液（预热至70℃）加在离心柱上，反复吹打3～4次，14 000r／min离心1分钟，即可得到mRNA样本。

（10） 如需提高mRNA量，可以重复加入等量OEB并再次离心。

可以使用 AllPrep DNA／RNA／Protein Mini Kit（Qiagen）同时提取组织中的 DNA、RNA 和蛋白成分。步骤如下：

（1） 将最多30mg的组织放置于合适的容器内，加入一定比例的RLT缓冲液（RLT使用前要加入β-巯基乙醇）匀浆。

（2） 14 000r／min离心3分钟，将上清液加在AllPrep DNA离心柱上，套在2ml收集管内，10 000r／min离心30秒，收集柱放置于4℃用于DNA提取，收集液用于RNA和蛋白质提取。

（3） 收集液中加250μl无水乙醇，吹打混匀，加在RNeasy离心柱上，套在2ml收集管内，10 000r／min离心30秒，收集柱放置于4℃用于RNA提取，收集液用于蛋白质提取。

（4） 加入与收集液等量的APP缓冲液，剧烈振荡，室温放置10分钟，14 000r／min离心10分钟，弃上清液。

（5） 加入 500μl 70% 乙醇，14 000r／min 离心 1 分钟，弃上清液。

（6） 室温放置10分钟待乙醇挥发。

（7） 加入100μl ALO缓冲液，剧烈振荡至沉淀溶解。

（8） 95℃孵育5分钟变性蛋白，恢复至室温。

（9） 14 000r／min离心1分钟以去除不溶物，则得到总蛋白。

提取的核酸分子在上机进行各类分子遗传检测前，需要进行定量和质量的评估。方法包括色谱法、荧光染色法和电泳法。这里介绍最为常用的色谱法。它的原理是DNA和RNA的吸收峰为260nm，蛋白的吸收峰为280nm，另外OD ₃₂₀用于背景评估。DNA和RNA的质量和纯度用公式（OD ₂₆₀-OD ₃₂₀）／（OD ₂₈₀-OD ₃₂₀）来表示。比值在 1．7～2．0 之间时，反映核酸纯度较高；<1．7提示有蛋白质或有机溶剂混入。定量公式为 ^［5］：

［1］Cheng L，Zhang DY，Eble JN．Molecular Genetic Pathology．2nd ed．New York：Springer，2013：211-219．

［2］Hewitt SM，Lewis FA，Cao Y，et al．Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology：Issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed，paraffin-embedded tissue．Arch Pathol Lab Med，2008，132（12）：1929-1935．

［3］Grü tzmann R，Pilarsky C．Cancer Gene Profiling，Methods and Protocols．New York：Humana Press，2010：39-52．

［4］Škerl P，Krajc M，Blatnik A，et al．Genetic testing and counseling of a recipient after bone marrow transplant from a sibling harboring a germline BRCA1 pathogenic mutation．Oncol Rep，2017，38（1）：279-282．

［5］Leonard DGB．Molecular Pathology in Clinical Practice．2nd ed．Switzerland：Springer，2016：20-22．