第三节 毛细管电泳法

毛细管电泳法是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据供试品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和（或）分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。

当熔融石英毛细管内充满操作缓冲液时，管内壁上硅羟基解离释放氢离子至溶液中，使管壁带负电荷并与溶液形成双电层（电位），即使在较低pH值的缓冲液中也是如此。当在毛细管两端加上直流电压时，将使带正电的溶液整体地移向负极端。此种在电场作用下溶液的整体移动被称为电渗流（EOF）。管内壁硅羟基的解离度与操作缓冲液pH值、添加的改性剂有关。降低溶液pH值会降低解离度，减小电渗流；提高溶液pH值会提高解离度，增加电渗流。有机添加剂的加入有时会抑制管内壁硅羟基的解离，减小电渗流，带电粒子在电场作用下以不同速度向极性相反的方向移动，形成电泳，带电粒子的运动速度等于其电泳速度和电渗速度的矢量和。电渗速度通常大于电泳速度，因此电泳时各组分即使是阴离子也会从毛细管正极端流向负极端。

一、分离模式

1．毛细管区带电泳（CZE）。

将待分析溶液引入毛细管进样端，施加直流电压后，各组分按各自电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子的顺序通过检测器。中性组分彼此不能分离。出峰时间被称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。

2．毛细管凝胶电泳（CGE）。

在毛细管中装入单体和引发剂，引发聚合反应而生成凝胶，这种方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。另外，还可以利用聚合物溶液（如葡聚糖等）的筛分作用进行分析，称之为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。

3．毛细管等速电泳（CITP）。

采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。

4．毛细管等电聚焦电泳（CIEF）。

将毛细管内壁涂覆聚合物以减小电渗流，再将供试品和两性电解质混合进样，在两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点（pI）时变为中性而形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液pH值的方法使溶质通过检测器。

5．胶束电动毛细管色谱（MEKC）。

操作缓冲液中加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂时，表面活性剂聚集形成胶束，其亲水端朝外，疏水端朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差异而被分离。

6．毛细管电色谱（CEC）。

将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相，以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离。

在以上分离模式中，毛细管区带电泳和胶束电动毛细管色谱使用较多。胶束电动毛细管色谱和毛细管电色谱的分离机理以色谱为主，但对荷电溶质则兼有电泳作用。在操作缓冲液中加入各种添加剂可获得多种分离效果。如加入环糊精、衍生化环糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、胆酸盐或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有机溶剂可改善某些组分的分离效果，以至可在非水溶液中进行分析。

二、对仪器的一般要求

毛细管电泳仪的主要部件和其性能要求如下。

1．毛细管。

使用弹性石英毛细管，内径以50μm和75μm两种规格使用较多（毛细管电色谱有时用内径更大些的毛细管）。内径小分离效果好，且焦耳热小，允许施加较高电压，但若采用柱上检测，则因光程较短，其检测限比内径较大管要差。毛细管长度称为总长度，根据分离度的要求，可选用20cm～100cm；进样端至检测器间的长度称为有效长度。毛细管常盘放在管架上并在一定温度下操作，以控制焦耳热。操作缓冲液的黏度和电导度对测定的重现性很重要。

2．直流高压电源。

采用0kV～30kV（或相近）可调节直流电源，可供应约300μA电流，有稳压和稳流两种方式可供选择。

3．电极和电极槽。

在两个电极槽中放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极。铂电极连接至直流高压电源，正、负极可切换。多种型号的仪器将试样瓶同时用作电极槽。

4．进样系统。

每次进样之前毛细管要用不同溶液进行冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力（加压）进样、负压（减压）进样、虹吸进样和电动（电迁移）进样等。进样时，通过控制压力或电压及时间来控制进样量。

5．检测系统。

紫外-可见分光检测器、激光诱导荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器均可用作毛细管电泳的检测器，其中以紫外-可见分光检测器应用最广，包括单波长、程序波长和二极管阵列检测器。将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池。对无光吸收（或荧光）的溶质的检测，还可采用间接测定法，即在操作缓冲液中加入对光有吸收（或荧光）的添加剂，在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰。

6．数据处理系统。

毛细管电泳的数据处理系统与一般色谱数据处理系统基本相同。

三、系统适用性试验

为考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用，系统适用性测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的计算式和要求也相同。如重现性（相对标准偏差，RSD）、理论塔板数（n）、分离度（R）、拖尾因子（T）等，可参照测定。具体指标应符合各品种项下的规定，特别是进样精度和不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。

四、基本操作

1．按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管温度、操作电压、检测波长和冲洗程序等。操作缓冲液需过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进样器。

2．毛细管的处理对测定结果影响很大。未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如用1mol/L氢氧化钠溶液，60℃）冲洗，使毛细管内壁生成硅羟基，再依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水和操作缓冲液各冲洗数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗。但若发现分离性能改变，则必须用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗，甚至要用浓氢氧化钠溶液升温冲洗。凝胶毛细管、涂层毛细管、填充毛细管的冲洗则应按照所附说明书操作。冲洗时，将盛溶液的试样瓶依次置于进样器，设定顺序和时间。

3．操作缓冲液的种类、pH值和浓度，以及添加剂[用以增加溶质的溶解度和（或）控制溶质的解离度，手性拆分等]的选定对测定结果的影响也很大，应按照各品种项下的规定配制，根据初试的结果进行调整和优化。

4．将待测供试品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始测试。根据初试的电泳图谱调整仪器参数和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式测试。

5．测试完毕后，用水冲洗毛细管。注意将毛细管两端浸入水中保存。如果毛细管长期不用，应将毛细管用氮气吹干。最后关机。

6．定量测定以内标法为宜。用加压或减压法进样时，供试品溶液黏度会影响进样体积，应注意保持供试品溶液和对照溶液黏度一致；用电动法进样时，被测组分因电歧视现象和溶液离子强度会影响迁移量，也要注意其影响。

（何勤 钱广生）