1.3　革兰氏阳性菌中单加氧酶基因（alkB）的研究

1.3.1　微生物降解烷烃的机理

石油中属于饱和碳氢化合物的有正构烷烃、分枝烷烃和环烷烃。在自然界中很多微生物可以利用烷烃，包括细菌、真菌和藻类，主要有Pseudomonas、Acinetobacter、Achromobacter、Bacillus、Micrococcus、Candida、Rhodotorula及Penicillium等。在石油混合物中，正构烷烃最易受到微生物的降解，甚至C₄₄或更长碳链的正构烷烃也能被某些微生物降解。其降解途径主要有四条（图1-2）。

1.3.1.1　单末端氧化途径

Fennewald等利用插入缺失的方法研究了Pseudomonas oleovorans GPo1烷烃降解途径，May等指出烷烃的降解通常是从烷烃链的一个末端开始氧化，即微生物产生的烷烃羟化酶（又称单加氧酶）攻击正烷烃的末端甲基，氧化产物为伯醇类化合物，伯醇类化合物依次被氧化成醛和脂肪酸，然后进入β-氧化途径产生乙酰COA，再进入三羧酸循环完全氧化成CO₂和H₂O，具体途径如下：

1.3.1.2　次末端氧化途径

Markovetz等研究发现Norcardia sp.等细菌降解烷烃时，发现烷烃氧化的第一步是从烷烃一端的第二位碳原子被氧化，其产物是仲醇类化合物，然后进一步氧化成酮、再氧化成酯（Ester），酯键裂解产生伯醇和脂肪酸，伯醇进一步被氧化成醛和脂肪酸，途径如下：

1.3.1.3　双末端氧化途径

Rehm等指出某些细菌和真菌能同时氧化长链烷烃的两个末端甲基，产生二羧酸产物，即所谓的ω-氧化：

在某些具有支链的烷烃中，由于分支链会阻碍β-氧化，微生物利用双末端氧化途径的这一方式可以避免这种情况发生。

上述三条途径中的第一步反应都是由烷烃羟化酶（又称单加氧酶）催化完成的。

1.3.1.4　双加氧氧化途径

Finnerty研究发现Acinetobacter sp.HO1-N菌氧化长链烷烃时，首先生成烷基氢过氧化物（Alkyl hydroperoxide），然后直接氧化成脂肪酸。

该途径中的第一步反应是由烷烃双加氧酶催化完成的。该途径后来被Maeng等研究Acinetobacter sp. M-1证实，并指出烷烃双加氧酶不需要NAD（P）H辅酶，但必须有分子氧（O₂）的参与。

1.3.2　烷烃羟化酶的种类

烷烃是一高度还原性物质，微生物对其降解的第一步是在烷烃分子中加入氧使其氧化为醇或酮，再进一步氧化为脂肪酸进入β-氧化途径进行氧化分解。其中催化烷烃氧化的第一步酶特别关键，因此对其研究也较多。目前，已发现的催化烷烃氧化的第一步酶的种类见表1-3。

尽管对烷烃的生物降解研究自1941年就开始了，但长期以来一直集中于酶学的研究，1963年Baptist等，指出Pseudomonas putida菌利用烷烃的第一阶段是将烷烃氧化成脂肪酸，然后进一步代谢。然而对其分子生物学的研究较晚，1973年，Chakrabarty发现在可利用中等链长（C₆～C₁₂）的烷烃中作唯一碳源和能源的P. putida GPo1（ATCC29347，曾被命名为P.oleovorans GPo1，或P.oleovorans TF4-1L）中，氧化烷烃的酶系是由一个大质粒OCT（辛烷降解质粒）上的基因编码的。

1977年，Benson、Fennewald和Shapiro等对P. putida GPo1的OCT质粒的alk基因作图表明：alk基因由两个相隔约40kb的转座子构成。1978年Fennewald等研究发现P. putida GPo1中alk基因的GC含量大大低于宿主菌基因组和OCT质粒，表明alk基因是整合在OCT质粒上的长约55kb的转座子的一部分。1979年，Benson等指出编码烷烃降解基因位于P. putida GPo1的OCT质粒上的两个基因簇内。

1979年，Fennewald等用一系列的突变互补实验证明，P. putida GPo1中alk基因聚集成两个基因簇，形成了两个被命名为alkBAC（可编码烷烃羟化酶、后来被证实为红素氧还蛋白的可溶性组分及醇脱氢酶）和alkR（可识别诱导物并调节alkBAC表达）的操纵子，这两个操纵子相距约40kb。alkBAC可被非氧化烷烃诱导，伯醇、安慰诱导剂如DCPK（二环丙酮）等也能诱导其高效表达。

1984年，Owen等发现转座子Tn7S只单方向插入alkBAC，并且以此方向相反的方向插入alkR，推断这两个操纵子的转录方向相反。1987年，Eggink及其同事从P. putida GPo1中的OCT质粒上用EcoR Ⅰ切出16.9kb和18kb长的两个片断，并将其克隆入pLAFRI黏粒载体中，构建成pGEC47质粒，为以后的研究创造了有利的条件。

Eggink、Kok和van Beilen等分析了插入pGEC47的alkBAC operon（7.5kb）和alkR的功能，并用小细胞（minicells）实验证实，18kb长的插入片断是编码双组分的烷烃羟化酶系和其他参与烷烃进一步氧化的各种酶的基因簇。

1992年，van Beilen等利用定点突变方法研究了P. putida GPo1菌株OCT质粒中alkB基因的功能，并利用融合蛋白的方法对AlkB蛋白的跨膜结构进行了研究。1994年，van Beilen等利用基因缺失互补的方法进一步研究了OCT质粒上alk基因功能，发现只有alkB、alkG和alkS不能被基因组上的基因所互补。

1999年，Canosa、Panke和Staijen等研究了插入pGEC47中的16kb片断中alkS基因的表达对烷烃单加氧酶基因alkB的转录调节作用，发现alkS基因是alk的调节基因。2000年，Canosa等进一步研究了alkS的正反馈机制，在烷烃的诱导条件下，烷烃降解基因的启动子被激活，整个基因簇表达。同时也发现了红素氧还蛋白还原酶基因alkT与调节基因alkS整合在一起，构成了独立于alkBAC之外的基因簇alkR。

alkBAC（1979年由Fennewald等命名）实际上由7个基因组成，可编码7个多肽：alkB编码烷烃羟化酶AlkB；alkF、alkG分别编码红素氧还蛋白AlkF和AlkG；alkH编码醛脱氢酶AlkH；alkJ编码醇脱氢酶AlkJ；alkK编码脂酰CoA合成酶AlkK；alkL编码一个功能未知的外膜蛋白AlkL，因而该操纵子后来被重新命名为alkBFGHJKL。

alkR由两个基因组成：编码具有诱导物识别功能的转录调节因子AlkS的alkS及编码红素氧还蛋白还原酶AlkT的alkT，因此alkR后来也被重新更名为alkST。

2001年，van Beilen等发现P. putida GPo1中alkBFGHJKL和alkST这两个操纵子的间隔序列只有9.7kb，其中在alkL下游2kb处有1.5kb的序列，可编码一个与接纳甲基趋化蛋白（MCP，可识别萘等）氨基酸序列同源性达30%的蛋白AlkN。像前述的alk基因一样，这个趋化受体基因的GC含量远低于OCT质粒和P. putida GPo1基因组。此外，alkN的起始密码子ATG的上游230bp的区域含有alkB基因的前76bp，并与alkB启动子的同源性高达56%，推测alkN编码烷烃趋化性转导蛋白。

在详细研究P. putida GPo1中OCT质粒上的alk基因的同时，其他能利用烷烃的微生物也受到广泛关注。1999年，Smits等用兼并引物的PCR方法和基因组测序对不同来源的G⁺和G^-烷烃降解菌的alk基因进行了比较研究，结果显示其他菌alk基因编码的蛋白质大都是P. putida GPo1中相应酶的同系物，同源性为43.2%～93.8%。但是P. putida P1中的alk基因位于基因组上，并且也形成两个操纵子alkBFGHJKL和alkST。平均而言，P. putida P1与 P. putida GPo1中相应的两个基因簇的ORF分别有80%和92%的序列相似性，且大多数的Alk蛋白显示出相似水平的同源性，功能一致，但P. putida P1的alk基因位于基因组上，基因间的相对位置也发生了改变。P. putida P1的alkST位于基因簇alkBFGHJKL的上游，两个操纵子的间隔序列也较短，alkN只剩残迹，称alkN'，位于alkL的下游135bp处，该距离只比alkBFGHJKL操纵子编码的间距稍远一点。van Beilen等认为alkN∕alkN'是以前存在的alkBFGHJKLN操纵子的一部分，只是在进化过程中，该操纵子被插入序列（IS）所打断。

2001年，Marin等从Burkholderia cepacia RR10的基因组上克隆出P.putida GPo1的alkB同系物（homologs）。2002年，Smith等从Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas fluorescens CHA0、Alcanivorax borkumensis AP1、Myco-bacterium tuberculosis H37Rv和Prauserella rugosa NRRL B-2295中克隆了alkB的同系物，并用缺失互补方法验证了其功能，同时对其alk基因的结构进行了比较分析（图1-3），发现不同AlkB蛋白之间的氨基酸序列同源性较低，只有35%左右；alk基因的结构在不同菌中有所差异，有些成簇存在，有些分散存在，并且不同菌株之间除了alkB基因外，其他基因在基因簇内并不一定出现；进化分析又表明Pseudomonas属不同物种的AlkB之间亲缘关系却较近。进行功能互补分析还发现P.fluorescens CHA0的alkB基因属于长链烷烃（C₁₂以上）降解基因，构建的alkB缺失菌P.fluorescens KOB2 Δ1可通过其他菌中的alkB基因互补，为分析和鉴定中长链烷烃降解菌的基因功能提供了较好的方法。另外，基因簇比较分析还发现在Pseudomonas aeruginosa PAO1的基因组中存在两个相似的alkB基因，并对其alk基因进行了功能互补分析。2004年，Hara和van Beilen等又对Alcanivorax borkumensis的alkB1和alkB2进行了功能鉴定，说明在一个菌的基因组上有可能存在多个烷烃降解基因簇。

2001年，Smits等构建了E.coli和Pseudomonas穿梭质粒pCom系列，该质粒含有P.putida GPo1的PalkB启动子和调节基因alkS，启动子能用烷烃或安慰诱导物二环丙酮（dicyclopropyl ketone，DCPK）诱导表达，并且该质粒与pLAFR衍生质粒和Pseudomonas 的表达质粒RSF1010相兼容，因此，pCom系列质粒的建立为研究烷烃降解基因的功能提供了很好的工具。

1999年，Gerßdörfer和Ratajczak等对Acinetobacter calcoaceticus ADP1的alk基因进行了研究，结果发现Acinetobacter calcoaceticus ADP1的alk基因也位于基因组上，与P. putida GPo1对应的基因同源性较高，但并不都形成操纵子，有些基因独立存在（图1-4）。在A. calcoaceticus ADP1中rubA（编码红素氧还蛋白）、rubB（编码红素氧还蛋白还原酶）、xcp（编码一种分泌蛋白）、oxyR（烷烃降解非必需基因，编码过氧化物反应调节因子）及estB（编码一种脂酶）组成一个操纵子，该操纵子与alkM（编码烷烃羟化酶）和alkR（编码alkM的转录调节因子）距离很远。但alkM和alkR距离较近，且转录方向相反。虽然这些基因与P. putida GPo1有所不同，但其编码的蛋白功能却相同，AlkM、RubA和RubB也形成一个类似于P. putida的三组分的烷烃单加氧酶复合物。

1996年，Sakai和Maeng等发现能利用长链烷烃的Acinetobacter sp.M-1，降解烷烃的最长碳链可达C₄₄。2001年，Tani等对Acinetobacter sp.M-1的烷烃降解基因与Acinetobacter sp.ADP1相似，但在Acinetobacter sp.M-1中存在着两套alk基因：alkMa和alkMb，并分别受各自的调节基因alkRa和alkRb调节（图1-4）。

然而，目前对G⁺菌的烷烃降解基因的分子生物学的研究较少。1998年，Cole等通过对Mycobacterium tuberculosis H37Rv基因组测序，预测并鉴定了其烷烃羟化酶基因；1999年，Smits等通过对G^-菌P.putida GPo1和Acinetobacter sp. ADP1的烷烃羟化酶氨基酸序列比对，发现了几处高度保守区，他们选择了分别包含两个保守区的编码序列设计出兼并引物，从G⁺菌Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531和Prauserella rugosa NRRL B-2295中扩增出alkB的相似序列，并用互补生长实验鉴定了其功能；2001年，Hamamura等又以相同的引物从Nocardioides sp.CF8扩增出了两个alkB类似物，并且G⁺菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv和Prauserella rugosa NRRL B-2295的alkB基因也能在G^-菌的烷烃羟化酶缺失菌Pseudomonas flourescens CHA0和P.putida GPo12（pGEc47ΔB）中实现功能互补，证明了两株菌的AlkB氧化烷烃范围为C₁₀～C₁₆，也为G⁺菌烷烃降解基因的研究提供了有利的工具。2002年，加拿大的Whyte和瑞士的van Beilen等联合报道了两株Rhodococcus属菌株Q15和NRRL B-16531的多重烷烃羟化酶系统，两株菌都有四个烷烃降解基因簇（图1-4），并且其alkB2基因簇结构与Mycobacterium tuberculosis H37Rv的alkB基因簇相似，但其他三个基因簇的结构相差较大；对各个基因簇的基因进行功能鉴定时又发现Q15和NRRL B-16531的alkB2能互补P.fluorescens KOB2Δ1中的alkB缺失（C₁₂～C₁₆），而不能在E.coli Gec137和P.putida GPo12中互补（C₆～C₁₂缺失），表明alkB2与C₁₂以上的烷烃羟化有关，并且只有NRRL B-16531的rubA2和rubA4能互补E.coli Gec137中的alkG 缺失，而Q15的rubA1和rubA2却不能互补，只有Q15的rubB能互补E.coli Gec137中的alkT缺失，而NRRL B-16531的rubB不能互补，从而说明两株菌的AlkB2至少与C₁₂～C₁₆的羟化有关，RubA2、RubA4和RubB主要是参与电子转移，其他基因的功能未能得到鉴定可能是没有合适互补表达系统。2002年，van Beilen等指出AlkB3、AlkB4常出现在能降解超过C₂₀的G⁺菌中，由于Rhodococcus降解烷烃的最大碳链长度为C₃₂～C₃₆，除了AlkB2检测到功能外，极有可能AlkB1、AlkB3、AlkB4分别参与C₁₈～C₃₆的不同碳链长度烷烃的氧化。因此，有关G⁺菌的长链烷烃降解的分子生物学研究还不清楚，引起了许多微生物学工作者对该领域研究的高度重视。

最近，van Beilen等发现Mycobacterium sp.菌株中有细胞色素P450烷烃羟化酶CYP153，该酶与以前属于膜蛋白的羟化酶明显不同，而与Acinetobacter sp. EB104中的羟化酶CYP153A1相似，属于胞内可溶性蛋白，但CYP153具有氧化C₁₂～C₁₆的功能，并在Pseudomonas GPo12中进行了功能互补，是一新的细胞色素P450家族成员。该研究为探索新的胞内可溶性烷烃单加氧酶提供了有利的依据。

近十多年来，从不同的环境中又分离到一些嗜热解烃的微生物。1993年，Sorkhoh等从科威特沙漠的石油污染区分离到一株能降解C₁₅～C₁₇的Bacillus（Geobacillus）stearothermophilus；2001年，Kato等从地下油藏中分离到一株在70℃能降解C₂₃的Bacillus thermoleovorans；2003年，Feitkenhauter等分离到一株能降解C₁₆的Thermus brockii；2005年，Nazina等从高温油田分离到两株能降解C₆～C₁₆的Geobacillus jurassicus。直到2007年，南开大学刘如林等从大港油田地层水中分离获得的嗜热采油菌Geobacillus thermodenitrificans NG80-2，克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因，并对其进行了功能鉴定。NG80-2的烷烃单加氧酶属于可溶性蛋白且具有耐高温的特性，是世界上首次对嗜热菌的烷烃降解基因研究。因此，探索和发现革兰氏阳性菌尤其是功能性嗜热菌的烷烃降解基因，将是一个艰巨的任务。