前言

外源微生物采油技术有重复性差和持续时间短等缺陷。存在这些问题的关键在于外源微生物的配伍比较盲目，没有理论指导和配伍标准，从而对内源微生物激活不具有很好的针对性，究其原因主要是缺乏对采油过程中油藏微生物群落结构的了解。采用分子生态学方法对高温油藏微生物群落进行多样性分析，并将得到的信息用于指导油藏微生物的分离是一项十分重要的工作。

编者用两种方法提取了油田采出水中的细菌总DNA，采用16S rDNA V3、V8、V9三个高可变区的引物对提取的DNA进行扩增，对PCR产物进行了变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。结果表明，采用酶法和化学法结合的方法提取水样中的总DNA，即可得到完整的DNA样品，经PCR-DGGE分析后能够得到较多的DNA条带；采用V9区引物扩增比V3和V8区引物能够得到更多的DNA条带，从而分析到更多的微生物信息。对水样中优势条带序列分析表明，在该油藏中存在的微生物与GenBank数据库中α，β，γ-变形菌和芽孢杆菌的序列相似性最高。以序列信息为指导，采用富集培养、直接培养和特殊培养的方法，从水样中分离出5株高温菌（而传统分离方法只能获得3株）。实验证实了其中3株能在55℃以上兼性厌氧条件下生长并降解原油，并使原油的黏度和凝固点显著降低。

利用多相分类技术，通过细菌的表型、生理生化指标、碳源试验、细胞壁组成、16S rDNA和基因组DNA分子杂交等实验，确定菌株DM-1为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis DM-1，菌株DM-2为嗜热脂肪芽孢杆菌，命名为Geobacillus stearothermophilus DM-2。

菌株DM-1在55℃高温缺氧环境中，能以烃为唯一碳源乳化并降解原油。在LB固体培养基上，DM-1能产生黏性脓胞样菌落，用产多糖培养基培养可产生胞外多糖使发酵液黏稠。该多糖物质经HPLC技术检测，其主要成分为甘露糖（91.87%）、葡萄糖（7.95%）和半乳糖（0.18%）；对菌株DM-1产多糖的最佳碳源和发酵温度进行了选择，发现该菌株在45℃时利用蔗糖为碳源发酵，其多糖产量可达1.7g·L^-1；利用非均质岩心模拟的调剖实验表明，DM-1的菌体及其产生的胞外多糖在岩石表面形成生物膜对岩石孔隙起到了封堵作用，使注入压力由0.01MPa增加到0.40MPa，渗透率降低了58.8%，采收率提高了3.9%，该菌株可用于微生物调剖。

菌株DM-2在60～65℃高温和缺氧条件下，能够以烃为碳源生长代谢，经分析表明，DM-2对原油的降解率可达70%，且对原油中各种正构烷烃均有不同程度的降解，说明该菌株对原油有很强的降解能力。同时，菌株DM-2以糖为碳源可产生一种新型生物乳化剂，该乳化剂对柴油、苯、二甲苯、煤油和原油等均有很好的乳化效果，在常温下形成EI-24值为100%的乳状液。该乳化剂对酸碱稳定，在pH1～pH14范围内对0^#柴油的乳化能力均为100%，经高温高压作用后活性稳定，且能耐受25%的高NaCl浓度。实验证明，该生物乳化剂由糖和蛋白组成，其中多糖含量约为38.6%，蛋白含量约为55.7%。经HPLC技术检测，其多糖组分为甘露糖（37.8%）、葡萄糖（31.9%）、半乳糖（28.0%）和葡萄糖醛酸（2.3%），蛋白部分主要由赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸组成。菌株DM-2产生的乳化剂能够提高烷烃和原油在水中的溶解度，形成水包油（O/W）乳状液，对高含蜡原油的乳化、分散效果明显，原油降解率达67.78%。矿场实验表明，DM-2菌株的发酵液乳化性能好，增油效果明显，极具应用前景。

采用PCR-DGGE技术对外源菌在油藏中的消长情况进行了监测，同时也得到了大量的内源微生物信息。由于外源微生物的注入，辽河油田两口井的原油产量均有明显提高，井26-195的日产油量平均为1.58t，井27-221的日产油量平均可达4.52t，而实施微生物采油技术之前这两口井的产油量几乎为零。序列分析表明，在这两口井中Proteobacteria是主要菌群，大多数是与烃降解相关的未培养微生物，这为功能性菌株的分离提供了信息。结合产油量曲线和DGGE图谱分析可知，采收率的提高与油藏内源和外源微生物群落的存在密切相关。

采用兼并引物扩增了两株高温解烃菌的alkB片段，通过序列比对和氨基酸序列分析，验证了这两段序列确实是alkB基因片段。对于烃降解微生物群落，alkB基因是编码关键酶的功能基因，在种群的功能分析上具有重要作用。目前芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的烃降解基因研究还很少，给分析工作带来很大困难，同时，如何将微生物种群与其生态功能联系起来是目前微生物生态学研究的一个难点。本研究为今后分离完整的烷烃降解基因和检测环境样本中的功能性种群奠定了基础。

王　君

二零一八年一月