2.3 实验方法
2.3.1 水样中细菌总DNA的提取
将1L水样用滤纸过滤后，4℃于5000r/min离心20min得菌体，用酶法和化学法相结合的方法提取基因组DNA，方法如下。
2.3.1.1 化学裂解法
离心所得菌体重悬于5mL 50mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）中，然后加入4mL 250mmol/L EDTA 和1mL 250mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 10mg/mL溶菌酶，轻轻摇匀后，37℃保温30min。加入1mL 10% SDS和200μL蛋白酶K，摇匀后55℃保温30min。然后进行蛋白抽提，加入与上清液等量的酚-氯仿-异戊醇溶液，反复抽提两次，直至中间层没有明显的蛋白质析出为止。将上清液转移到新离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇溶液，室温静置30min；常温下10000r/min离心20min，倒弃上清液，干燥后加入1mL 70%乙醇洗涤，离心去除酒精风干后，将沉淀溶于500μL TE缓冲液（10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8）中。所提取DNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳进行观察，通过测定样品在260nm的吸光值进行定量分析，确定所提取DNA的浓度。
2.3.1.2 液氮研磨法
离心所得菌体重悬于5mL 50mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）中，先用液氮进行研磨破碎细胞，再加入4mL 250mmol/L EDTA和1mL 250mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 10mg/mL溶菌酶作用，后续步骤同上。所提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。
2.3.2 基因组总DNA高可变区的扩增
从水样基因组中扩增细菌16S rDNA的V3、V8和V9可变区片段（表2-1）。扩增反应体系50μL，包括5μL 10×Buffer、4μL dNTP Mixture（各10mmol/L）、1μL正向引物（20μmol/L）、1μL反向引物（20μmol/L）、1μL DNA模板和1U Taq DNA聚合酶；PCR扩增采用TouchDown PCR方法，改进后反应条件为：94℃预变性5min，循环过程为94℃ 1min，退火温度 1min，72℃ 3min（其中退火温度从65～52℃，每个温度3个循环）；之后再进行15个循环（94℃ 1min，55℃退火1min，72℃ 3min）；72℃再延伸10min，4℃终止。每个反应设置一个空白对照，即在反应体系中不添加模板而是用同体积无菌水替代，以排除引物等污染的可能。PCR反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来消除普通PCR过程中的单链DNA和杂合双链DNA污染。
表2-1 所用引物的序列
Table2-1 Primers and protocols used for PCR experiments
注：F，Forward primer；R，Reverse primer；GC*是一段约40bp的富含GC的序列， 其序列为： 5'-CGC CCGCCGCGC CCC GCGCCC GTC CCGCCGCCC CCGCCC-3'。
2.3.3 16S rDNA序列可变区的DGGE分析
16S rDNA的V3、V8和V9可变区PCR扩增片段利用DcodeTM Universal Mutation Detection System（Bio-Rad）进行DGGE分离。胶板面积为16cm×16cm。DGGE条件为：6%的聚丙烯凝胶，40%～60%的变性剂梯度（100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），将200ng PCR产物加入点样孔中，在7L 1×TAE缓冲液中，60℃恒温，160V恒压条件下电泳200min。电泳完毕后用EB染色，在添加20μL 10mg/mL EB的250mL 1×TAE缓冲液中染色5min后，在相同体积1×TAE缓冲液中脱色后，通过Bio-Rad凝胶成像系统来成像。
2.3.4 DNA片段序列分析
切割凝胶上的优势条带用Biospin聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收，所得DNA片段用不带GC夹的V9区引物扩增后连接到pGEM-T载体上，采用CaCl2法转化入E.coli DH5α中。
待转化子长出后，从每个条带对应的大量转化子中随机挑选三个白色菌落，通过酶切鉴定为阳性转化子后，送至北京三博测序公司测序。如果这三个克隆序列不一致，需挑选更多的转化子进行测序，目的是消除DGGE弥散条带的干扰及回收时的污染。序列测定使用ABI 377自动测序仪和T7引物。将测序结果在GenBank/EMBL/DDBJ中比对，以确定其进化地位和亲缘。序列差异小于3%即被认为属于同一种系型，每个种系型都有对应的序列。采用Clustal X进行序列的比对，用Mega3.1软件中Kimura Two-parameter模和neighbor-joining算法进行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较，构建系统发育树。
2.3.5 高温解烃菌的分离
2.3.5.1 传统富集培养法分离
取水样振荡均匀后用无菌移液管取10mL，接种至100mL含有2%液蜡的无机盐培养基中（培养基组成：KH2PO4 0.3g；Na2HPO4·12H2O 1.25g；NH4Cl 2.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2·2H2O 0.01g；FeSO4·7H2O 0.36g；酵母提取物0.5g；蔗糖1.0g；蒸馏水1000mL；pH=7.2），55℃振荡培养5d。将富集培养液充分混匀，涂布在营养肉汤琼脂平板或无机盐液蜡琼脂平板上，50～70℃培养2d，观察长出的菌落。
2.3.5.2 直接培养法分离
直接取水样涂布在地层水上清液琼脂平板上，50～70℃兼性厌氧培养2～14d，观察长出的菌落。挑取单菌落划线培养并用显微镜检验其纯度。
2.3.5.3 特殊培养法分离
模拟油田实际水样组成加入氮源、磷源或生长因子，50～70℃兼性厌氧培养2～14d，然后将培养液分别涂布在营养肉汤琼脂平板、10倍稀释的营养肉汤琼脂平板或无机盐液蜡琼脂平板上，挑选长出的不同菌落。
2.3.5.4 高温解烃菌的选育
将高温下生长的各个菌落，接种至普通LB液体培养基中，培养至OD630nm为0.8左右，作为种子液以10%（体积比）比例接入100mL无机盐液蜡培养基中，50～70℃兼性厌氧培养5d。以此为种子液，接种至新鲜的无机盐液蜡培养基中，反复驯化菌种3～4次，选取对液蜡乳化良好的菌种，接至以原油为碳源的无机盐培养基中，测定菌株对原油的降黏、降凝效果，并使用红外测油仪测定菌株对原油的降解率。
2.3.6 高温解烃菌的16S rDNA鉴定
2.3.6.1 小量提取细菌基因组总DNA
①挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃振荡培养24h。
②转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清。
③将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液。
④将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris （pH 8.0）缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配制的溶菌酶溶液（10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0）和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min。
⑤加入等体积的酚-氯仿（1∶1），盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min。
⑥转移上相至新的离心管中，重复步骤⑤直到无白色变性蛋白层出现。
⑦取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h。
⑧重复步骤⑤。
⑨在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2）和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min。
⑩4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。
2.3.6.2 PCR扩增16S rDNA序列
①以上述细菌基因组总DNA为模板，扩增所用引物为：上游引物5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；下游引物5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。
②PCR反应体系
③PCR反应条件
94℃预变性5min，94℃ 45”，56.2℃ 45”，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 9min，4℃停止。
④纯化PCR产物
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，使用天为时代柱式回收试剂盒回收纯化PCR产物。
⑤PCR产物测序
直接采用pGM-T easy vector system kit，4℃连接过夜，转化CaCl2法制备的DH5α感受态（分子克隆），转化子在含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上，进行蓝白斑筛选，选择有合适大小插入片段的单克隆测序，测序工作由北京三博远志生物有限责任公司完成。
2.3.6.3 构建进化树
将菌株16S rDNA的序列与GenBank数据库中序列比对，同3.4方法构建系统发育树。