3.2 土壤微生物特性研究方法
目前能够被分离培养的微生物种类不到整个已知微生物的1%，有关土壤微生物数量、分类及鉴定方法多采用传统方法，如平板计数法、表型特征、显微镜观察、平板接种培养等，因平板菌落计数的结果往往偏低，所得结果误差甚大，另外，有些种类在人工培养基上无法产孢，很难从形态方面进行鉴定。因此传统分析方法有一定的局限性。由于生态环境地理区域的差异，土壤微生物数量、种类及组成极易受诸多生态因素的综合影响，因此局部区域的研究结果无法反映其地理分布规律。传统的分离培养方法难以分析那些对环境条件要求苛刻的真菌，目前人们只能分离鉴定大约全部微生物的1%左右，绝大多数微生物都还是未知的，并且能成功培养的物种则不一定是自然环境中具有重要生态作用的优势种。不同微生物的生理特性、营养要求各不相同，但尚无一种培养基能适合所有真菌生长。针对免培养的微生物，从生态和进化角度考虑对其多样性进行进一步的研究十分必要。
3.2.1 可培养微生物的研究
可培养微生物的研究主要采用依赖可培养手段的琼脂培养的传统微生物分析方法，包括分离培养法、底物利用分析法；根据不同实验目的选取不同种类的培养基，在不同温度等培养条件下对土壤微生物进行恢复培养，以获取菌落形成单位的数量和不同种类的微生物，并对单个菌株进行分离纯化，特别是对菌株生理生化特性的研究上具有其他方法不可替代的优势。可培养微生物的研究存在一些不足：a.虽然平板分离培养技术被认为是土壤微生物研究的重要里程碑，但由于微生物体积小、形态简单，基于纯培养技术的表型特征分类具有较大的局限性，从分类学的角度准确刻画和定义土壤中数量巨大的微生物类群，一直是学术界的重大理论和技术问题；b.由于长期以来由于理论和技术的限制，从土壤学的角度很难定量研究微生物区系在复杂土壤环境中动态变化规律，从而原位表征微生物区系的演变特征及其在农业生产实践中的重要作用；c.由于微生物不像多细胞动植物那样具有形态和结构的多样性，很难从形态上进行分门别类，开展属种水平的研究。因此传统的微生物分离和培养技术给微生物群落分布格局的研究带来了一定的难度。
3.2.2 不可培养微生物的研究
不可培养的微生物在土壤中占据比例较大，可达左右99%，其功能尚未可知。就研究群落结构而言，免培养的微生物的群落结构和多样性的研究非常重要，研究方法有以下几类。
①基于其他大分子生物标记物的磷脂脂肪酸PLFA分析法（Phospholipid Fatty-acid Analysis. PFLA）。
②以PCR为基础的构建克隆文库（Conly library）、限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）；末端限制性内切酶片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）分析、变性梯度凝胶电泳（DGGE，TGGE）等。
③以rRNA为基础的生物三域分类理论逐渐得到学术界认可，以rRNA序列比对为基础的分子指纹图谱技术极大地改变了传统的研究理念和方法，将土壤微生物学的研究对象从单个菌种资源发展到整体的微生物群落演替及功能意义。
④DNA测序技术快速发展并在分子生态学中得到了广泛应用。克隆文库和聚丙烯酰胺凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）等为代表分子指纹谱图技术极大地推动了微生物生态学的研究。
这些技术以复杂环境样品如土壤为研究对象，直接提取其中微生物的基因组DNA，进一步采用16S rRNA 基因的通用引物获得所有微生物的PCR扩增产物，通过构建16S rRNA基因的克隆文库，或者开展DGGE凝胶电泳分析，比较克隆子或者DGGE条带的序列，推测复杂环境微生物群落的分类学地位及其对环境条件的响应与适应机理。与克隆文库技术相比，DGGE更加简单高效，能够同时最多分析32个样品，其条带的数量和亮度可以较好地指征土壤主要微生物类群的变化。然而，每克土壤中微生物据估算高达（1～10）亿，传统的分子指纹图谱如DGGE和克隆文库获得的微生物DNA序列通常低于100条，检测限低、工作量大，特别对于土壤中数量少，但具有重要功能的土壤微生物类群区系，传统分子指纹图谱技术具有较大的局限性。
⑤最新发展起来的高通量和高分辨率的宏基因组学、环境转录组学等技术，如454-焦磷酸高通量测序和实时荧光定量PCR（Real time Quantitative，PCR）；21世纪以来，新一代高通量测序技术的发展日新月异，可直接测序16S rRNA基因的PCR产物，每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计，不仅通量高，而且能够同时分析上百个不同的样品，是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具。
2007年焦磷酸高通量测序技术首次应用于土壤微生物16S rRNA基因遗传多样性研究，焦磷酸测序省去了构建克隆文库过程中的复杂步骤，在扩增引物前加上相应的序列标签，经一次性测序完成实验，速度快、通量高，所得多样性信息比传统Sanger文库高出几个数量级。随着分子生物学技术的发展，宏基因组高通量测序技术为免培养微生物系统发育的多样性研究提供了有力的帮助。迄今在ISI科学引文数据库已有500余篇土壤微生物相关论文报道。然而，相比于传统分子指纹图谱技术，新一代高通量测序的技术优势仍处于一种定性的描述，尚未见系统的技术评价报道。
⑥ITS-rDNA是目前真菌物种分辨率最高的单一DNA片段，可使真菌物种的分辨率达到72%，其主要优势在于片段长度合适（约500 bp）、引物通用性强、扩增成功率高，便于高通量测序与分析，而且在GenBank和BOLD等生命条形码数据库中存有较多的DNA片段序列、凭证标本和菌种，便于分析。
ITS现已广泛应用于外生菌根真菌物种多样性的检测与鉴定。因此基于真菌ITS系统发育多样性的研究，为土壤真菌多样性的研究奠定了基础。另外在不满足于遗传多样性信息的基础上，为了获取微生物生理代谢功能多样性，还需要借助Biolog EcoplateTM的分析方法，将含有微生物群落的环境样品稀释液，加入预先制备好的标准化培养基和不同种类碳源的孔平板中，随着可培养细菌群落的生长繁殖，碳源类底物被代谢消耗的过程中会产生游离电子，与板中的四唑盐颜料发生还原显色反应后，根据颜色的深浅判断碳源被代谢利用的程度，可获取整个群落对不同种类单一碳源利用的指纹图谱，称为群落水平生理图谱（Community Level Physiological Profiles CLPPs），由此指征微生物群落的功能特征。
⑦诸如qPCR、稳定性同位素探针（SIP）和二级离子质谱（NanoSIM）技术等。这些方法从不同层面对土壤微生物群落组成及多样性、丰度、活性和功能进行研究，有助于了解土壤微生物多样性和功能的全貌。