第四章 免疫学基因检测技术
第一节 免疫PCR技术
一、概述
（一）免疫PCR技术的概念与基本原理
免疫PCR （immuno PCR， Im-PCR） 是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性相结合而建立的一种微量抗原检测技术。
用抗体检测抗原是免疫学的最基本方法，用酶或同位素标记抗体可使检测的敏感性提高。免疫PCR是在ELISA基础上，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，可定量检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原，敏感性高于ELISA和RIA。
免疫PCR反应体系由待测抗原、生物素标记特异性抗体、蛋白A-链亲和素 （连接分子）、生物素化DNA、PCR扩增体系五部分构成，实验过程分为两大主要阶段：①免疫反应阶段，类似于ELISA过程。用待测抗原包被微滴板孔，再加入相应的特异性抗体，抗体与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物；蛋白A-链亲和素（protein A-streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲和素部分可与生物素化的pUC19（biotin-pUC19，质粒DNA）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。②PCR检测阶段，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。免疫反应阶段中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应引物存在下，可经PCR在几小时内放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。
（二）免疫PCR技术的分类
1.原位免疫PCR
原位免疫PCR（in situ immune PCR）是一种原位检测组织或细胞中抗原的技术，结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术优点，是细胞学科研与临床诊断领域的一项有较大潜力的新技术，所用标本包括新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。
2.细胞免疫PCR
通常用来检测细胞表面膜抗原，我国科学家用细胞免疫PCR（cellular immune PCR）成功检测了白血病患者血清中转移癌细胞上的肿瘤抗原GM3。首先用抗GM3单抗制备单抗-亲和素-生物素化复合体，然后分离患者外周血淋巴细胞，充分洗涤封闭后，与单抗DNA复合体共育，洗涤后抽提细胞总DNA，利用DNA报告分子的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经Southern blot显示结果，患者外周血淋巴细胞可扩增出300bp的特异性条带，而正常人无此条带。
3.多分析物免疫PCR
利用大小不同的DNA分子标记不同的抗体，可同时检测多种抗原。美国科学家Joerger等人用99个碱基的DNA分子标记hCG抗体，用88个碱基的DNA分子标记hTSH抗体，同时检测hCG、hTSH两个分析物，两个DNA报告分子共用一对引物，但PCR产物的分子量不同，从而使两个抗原得以鉴别。
4.单引物免疫PCR
即DNA报告分子的两侧含有相同的引物序列，可用单引物进行PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适合于多分析物免疫PCR同时检测多种抗原。
（三）免疫PCR技术的优点
免疫PCR技术结合了抗原抗体结合的特异性与PCR扩增技术的敏感性，因此具有更高的特异性与敏感性，其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2ng/L的抗原物质，为现有任何一种免疫定量方法所不及，特别适合极微量抗原的检测，在细胞因子、肿瘤相关抗原、微生物感染等检测分析方面有着不可比拟的优势。
二、免疫PCR关键技术
（一）材料与方法
1.生物素标记特异性抗体的制备
免疫球蛋白（例如：IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的生物素酰肼（biotin-hydrazide）作生物素标记。
①将纯化的抗体（IgM或IgG，0.1～1.0mL）在标记缓冲液（0.1mol/L NaAc，pH值5.5，0.1mol/L NaCl）中4℃透析过夜。
②吸取0.5mL至微量离心管中，加入过碘酸钠溶液至终浓度为10mmol/L，置冰浴于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
③将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开，收集蛋白峰。
④向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide（Pierce）至终浓度5mmol/L，置混摇器上室温孵育1h。
⑤用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，-20℃保存。
2.生物素标记DNA片段的制备
作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA以检测人源标本。DNA片段大小为300～500bp，生物素标记可采用PCR法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5'端碱基上带有生物素标记。在0.5mL PCR管中按表4-1将各试剂混合。
表4-1 PCR反应体系
混匀后覆盖液体石蜡。95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min；40个循环。最后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10μL 3mol/L KAc（醋酸钾）、250μL无水乙醇，置-70℃ 30min。
离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，-20℃保存。
3.抗体-亲和素-DNA复合物的制备
将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mL BSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。之后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达1mg/mL，分装后-20℃冻存。
4.免疫PCR
①按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加至96孔塑料板或0.5mL PCR管中，4℃过夜。
②用PBS洗三次，然后每孔加200μL封闭液（PBS含10mg/mL BSA，1mg/mL鱼精DNA），室温孵育30min。
③用TETBS（含20mmol/L EDTA、0.02%NaN3）洗三次。
④将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mL BSA和0.1mg/mL鱼精DNA的TETBS中，每孔加50μL，室温孵育1h。
⑤用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
⑥每管中加50μL PCR反应液，成分见表4-2。
表4-2 PCR反应体系成分
混匀后覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min。最后72℃延伸10min。
每管取5μL做琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入放射性核素标记，则可用X光片显影。亦可在凝胶电泳后做Southern blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
（二）注意事项
本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此需要优化反应条件，以使每个链亲和素分子既能结合抗体分子，又能结合DNA片段。此外，还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5'端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发反应偶联。例如：用N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯（N-succinimidyl-S-acetyl thioacetate，SATA）活化氨基修饰的DNA片段，用磺基琥珀酰亚氨基-4-（马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯［sulfo-succinimidyl 4-（maleimidomethyl） cyclohexane-1-carboxylate，Sulfo-SMCC］修饰抗体分子，然后将二者混合，通过加入盐酸羟胺（hydroxylamine hydrochloride）使发生偶联。
免疫PCR具有高敏感性，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因此，在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也非常重要，可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白作蛋白封闭剂、鱼精DNA作核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的共同问题之一。即使每一步非常谨慎，重复使用同样的引物和标记DNA亦会产生假阳性信号。免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定，因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。