4.2 分子荧光和磷光的原理
4.2.1 分子荧光和磷光的产生
处于基态的分子在吸收适当能量（光能、电能、化学能、生物能等）后，其价电子从成键轨道或非键轨道跃迁到反键轨道上去，这就是分子激发态产生的本质。激发态不稳定，通过释放能量衰变到基态。激发态在返回基态时常伴随光子的辐射，这种现象称为光致发光。所谓光致发光是指分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射现象。荧（磷）光的产生属于分子的光致发光现象。
每个分子都具有一系列的电子能级，每一个电子能级中又包含了一系列的振动能级和转动能级。图4-1中基态用S0表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用S1和S2表示，第一电子激发三重态和第二电子激发三重态分别用T1、T2表示，基态和激发态的振动能级用ν=0、1、2、3、…表示。
图4-1 荧光和磷光体系能级图
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同。电子激发态的多重度可用m=2s+1表示，其中s为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。当所有电子都配对时，s=0，m=1，分子的电子态处于单重态，用符号S表示，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，此时分子处于激发的单重态。当两个电子是平行自旋的，s=1，多重度m=3，分子的电子态处于三重激发态，用符号T表示。根据洪特规则，处于独立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定，所以三重态的能级要比相应的单重态能级略低（见图4-1中的S1和T1，S2和T2）。
处于激发态的分子是不稳定的，将以辐射跃迁或非辐射跃迁等方式返回基态，这个过程称为分子的去激发过程，而去激发过程包括了多个可能的途径，其中对大多数分子而言，当分子处于第一激发单重态S1的最低振动能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转换过程慢得多。分子可能通过发射光子跃迁回到基态的S0的各个振动能级上，这个过程称为荧光发射。图4-1中λ3所表示的波长，荧光发射过程约为10-8s。激发态分子经过系间跨越到达激发三重态后，经过迅速的弛豫到达第一电子激发三重态（T1）的最低振动能级上，再从T1态经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁（即T1→S0），故属禁阻跃迁，因此磷光的寿命比荧光要长得多，约为10-3s或10s。
4.2.2 荧光量子产率
荧光的量子产率，也称为荧光效率，用Φ表示，是发射荧光的分子数与总的激发态分子数之比
（4-1）
式中，kf为荧光发射过程的速率常数；∑ki为无辐射跃迁过程的速率常数的总和。由上式可知，凡是能够使kf值增加而使其他的k降低的因素都可以增强荧光。通常kf主要取决于分子的化学结构，而∑ki主要取决于化学环境，同时与化学结构有关。
4.2.3 激发光谱和发射光谱
荧光属于光致发光。荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。
荧光的激发光谱：通过固定荧光的最大发射波长，改变激发光的波长，测量荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到了荧光的激发光谱曲线。
荧光的发射光谱：通过固定荧光的激发波长，改变发射光的波长，测量荧光强度，以发射光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到了荧光的发射光谱曲线。
室温下萘的乙醇溶液荧光激发光谱、荧光发射光谱和磷光光谱见图4-2。
图4-2 室温下萘的乙醇溶液荧光激发光谱、荧光发射光谱和磷光光谱
A—荧光激发光谱；F—荧光发射光谱；P—磷光光谱
通常情况下荧光发射光谱的发射波长大于激发波长，这种现象称为斯托克斯位移。这种激发和发射之间的位移是由振动弛豫内转换瞬间能量损失产生的。
一般情况下，分子的荧光发射光谱与其吸收光谱之间存在镜像关系。图4-3是苝在苯溶液中的吸收光谱和荧光发射光谱图。由图可以看出吸收和发射间存在较好的镜像关系。镜像对称规则的产生是由于大多分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构类似，因此吸收光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。实际大多数化合物虽然存在这样的镜像关系，但其对称程度不如苝分子。
图4-3 苝在苯溶液中的吸收光谱和荧光发射光谱图
4.2.4 荧光与分子结构的关系
荧光与物质分子的化学结构密切相关。一般具有强荧光的分子都具有大的共轭π键结构、供电子取代基和刚性平面结构等，有助于荧光的发射。因此，分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而饱和的或只有孤立双键的化合物，无显著的荧光。结构对分子荧光的影响主要表现在以下几个方面。
4.2.4.1 跃迁类型
大量的实验结果证明，多数荧光化合物都是由π→π*或n→π*跃迁所致的激发态去活化后，发生π*→π或π*→n跃迁而产生的，其中π*→π跃迁的量子效率较高，原因是：①π→π*跃迁的摩尔吸光系数比n→π*跃迁大100～10000倍，跃迁的寿命（10-9～10-7s）又比n→π*跃迁寿命（10-7～10-5s）短，则Kf较大；②系间跨跃的速率常数小，有利于发射荧光。
4.2.4.2 共轭效应
芳香族化合物含有π→π*跃迁有利于荧光发射，因为共轭效应能增加荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多激发态分子，从而有利于荧光的发生。实验证明，易于实现π→π*跃迁的芳香族化合物容易发出荧光，而脂肪族化合物（除少数高度共轭体系化合物外）极少能发出荧光。体系的共轭度越大，则π电子的离域性越大，荧光越容易发生，灵敏度和荧光效率也越大。
4.2.4.3 取代基效应
苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。通常，供电子基团，如—NH2、—OH、—OCH3和—NHCH3等，使荧光增强；而吸电子基团，如—Cl、—Br、—I、—NHCOCH3、—NO2和—COOH等，使荧光减弱。
4.2.4.4 刚性平面结构的平面效应
实验表明，具有刚性平面结构的有机分子具有较强的荧光，这是由于它们与溶剂或其他溶质分子的相互作用较小，通过碰撞去活化的可能性较小，从而有利于荧光的发射。例如，荧光素和酚酞结构相似，前者分子中氧桥使其具有刚性平面结构，因而具有较强的荧光；后者不易保持平面构型，没有荧光。又如芴，由于其分子中存在成桥的亚甲基，使刚性增加，从而有较强的荧光，其量子效率接近于1，而联苯在同样条件下的荧光量子效率仅为0.20。
总之，荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发光强度与物质分子吸光作用及荧光效率有关，荧光与物质的化学结构密切相关，若能增加分子的共轭度或存在刚性平面结构，则可以增强荧光的强度；反之，则荧光减弱。分子所处的环境对其荧光发射也存在直接的影响，因此，合理地优化实验条件，有助于提高荧光分析的灵敏度和选择性。