1.2　堆肥过程胡敏酸与富里酸结构演变规律

1.2.1　堆肥过程胡敏酸与富里酸含量变化

腐植酸可作为电子受体接受微生物进行腐殖质呼吸时产生的电子，并促进微生物的生长^［14］，因此，腐植酸含量及组成对腐殖质还原菌种群结构必然产生影响。由图1-5（a）可见，堆肥过程中腐植酸的含量总体呈上升趋势，然而不同物料变化规律不完全相同。堆肥过程鸡粪、牛粪及污泥中腐植酸含量上升速率较快，到高温期分别增加了27.5%、32.2%和33.1%；而果蔬、杂草和秸秆分别增加了3.5%、16.9%和15.2%；枯枝变化趋势与其他物料呈相反趋势，其腐植酸含量降低了32.7%。由此可以推测，在升温期，纤维素及木质素类物料不利于腐植酸的合成，而蛋白质含量较丰富的物料在堆肥的初期阶段更易形成腐植酸，腐殖质还原菌数量有可能会随之升高。在高温期，不同物料腐植酸含量均呈明显上升趋势，说明堆肥后期是形成腐植酸的主要阶段。

作为腐植酸的重要组成部分，胡敏酸的变化趋势与腐植酸基本相同，其浓度随堆肥过程呈增加趋势，见图1-5（b）。富里酸与之不同，在果蔬、杂草、秸秆及枯枝中总体上其含量呈降低趋势，见图1-5（c）。但在鸡粪、牛粪及污泥中，富里酸呈先升高后降低的趋势，这说明在蛋白类物料的升温期，富里酸较易形成，但随堆肥腐殖化进行，含量随之降低^［15］。

1.2.2　堆肥过程胡敏酸与富里酸结构演变规律

1.2.2.1　堆肥胡敏酸与富里酸的紫外光谱特征

（1）SUVA₂₅₄

有机物在254nm下的紫外吸收代表具有不饱和碳碳键的芳香族化合物，记为SUV。在相同的碳浓度下，该波长下吸光度的增加，意味着非腐植酸向腐植酸的转化，SUVA₂₅₄可用于表征有机质的芳构化程度，其值越高，芳构化程度越高。如图1-6（a）、图1-7（a）所示，胡敏酸与富里酸中SUVA₂₅₄随堆肥的进行而升高，表明堆肥过程中腐植酸的芳香化程度不断增加。与堆肥初期相比，鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、枯枝、秸秆及污泥中胡敏酸浓度在堆肥过程中分别增加了8.2%、17.3%、20.4%、30.3%、39.3%、23.8%及18.6%；富里酸浓度在堆肥过程中分别增加了12.5%、13.8%、12.8%、8.6%、7.2%、9.5%及12.3%。表明堆肥过程中，非腐植酸类物质不断转化为腐植酸类物质，堆肥的稳定度也有一定程度的增加。堆肥过程中有机质变化过程包括降解与腐殖化，随着堆肥中有机质的逐渐降解，形成富里酸，然而到高温期，部分功能基团与有机组分如多酚、羧基、富里酸被逐渐降解，从而堆肥的腐植酸逐渐增加。胡敏酸SUVA₂₅₄在果蔬、杂草、枯枝及秸秆的增加量要略高于鸡粪、牛粪及污泥，说明纤维素类、木质素类物料在堆肥过程中的腐殖化程度要高于蛋白类物料。Zhao等^［17］认为堆肥腐植酸主要由纤维素、木质素类物质的不完全降解产物及氨基酸结合而成，因此，随着堆肥过程中木质素及纤维素类物质的不断降解缩合，堆肥腐殖化程度逐渐增加，致使其吸光度逐渐增大。

（2）E₄/E₆

E₄/E₆是一个用来表征苯环碳骨架缩合度、芳香化合物的聚合度、分子量大小以及腐殖化程度的传统参数，该值与有机质缩合度呈反比^［18］。由图1-6（b）可知，该值在鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、枯枝、秸秆及污泥堆肥过程中呈降低趋势，说明胡敏酸的缩合程度随堆肥过程逐渐增加。该值在纤维素类物料（果蔬和杂草）中降低了9.83和10.47，说明苯环碳骨加缩合度、芳香化合物的聚合度及分子量最高。如图1-7（b）所示，富里酸中E₄/E₆在不同物料分别降低了3.06、3.77、5.06、5.77、2.05、6.22及7.19，其中，鸡粪、牛粪和污泥在堆肥高温期E₄/E₆降低明显，在腐熟期变化较为平缓；果蔬、杂草、枯枝及秸秆则在堆肥过程中呈持续降低的趋势。说明蛋白质类物料堆肥过程中官能团的缩合主要发生在高温期，而纤维素、木质素类物料的腐殖化过程则发生在整个堆肥过程中。这主要是由于蛋白类物料在堆肥前期较易降解，微生物活动较强，加速了堆肥前期的腐殖化过程，而纤维素、木质素类物料与之相反，微生物活动较弱，随着堆肥温度上升，适应堆肥环境较为缓慢，物质分解与转化速率相对较弱^［19］。

（3）A_226-400

在有机质的紫外吸收光谱中，226～400nm下的吸收带是由具有多个共轭体系的苯环结构引起的，这一范围基本反映了有机质的吸收光谱特性，可从整体上研究堆肥胡敏酸、富里酸的苯环类化合物及芳构化程度的变化^［20］。本研究分别对胡敏酸与富里酸在226～400nm范围内的吸光度进行积分，结果如图1-6（c）所示，该值在鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、枯枝、秸秆及污泥中分别增长了9.8%、17.1%、32.4%、38.5%、45.0%、24.4%和16.5%，说明随着堆肥的进行，胡敏酸中苯环类化合物不断增多。纤维素、木质素类物料（果蔬、杂草、枯枝及秸秆）的增加量明显高于蛋白类（鸡粪、牛粪）与污泥，说明纤维素、木质素类物料的腐殖化的速率要高于蛋白类物料。A_226-400在富里酸中呈现出相同趋势［图1-7（c）］。与堆肥初期相比，鸡粪、牛粪及果蔬的增加量最高，分别增加了14.0%、14.6%及12.6%，明显高于杂草（3.6%）、秸秆（6.7%）、枯枝（4.9%）及污泥（7.2%）。这是由于在鸡粪、牛粪、果蔬中微生物繁殖迅速，降解速率快，进而促进堆肥过程的芳香化及腐殖化程度^［8］。

（4）S_R

S_R是一类表征有机质分子量的重要参数，并与分子量呈反比。堆肥过程中S_R呈降低趋势，说明随着堆肥进行，腐植酸的分子量逐渐增大^［21］。如图1-6（d）所示，该值在鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、枯枝、秸秆及污泥的堆肥过程呈阶段性降低，分别降低了0.11%、0.26%、0.40%、0.29%、0.34%、0.32%及0.26%，说明堆肥过程中胡敏酸分子量呈逐渐升高的趋势。其中，杂草在高温阶段出现显著降低，说明该物料的分子量在堆肥的高温期变化剧烈。不同物料中富里酸在堆肥升温期差异较为显著［图1-7（d）］，在鸡粪、牛粪和污泥中，其值随堆肥过程呈显著降低（0.74、0.52和0.61），明显高于果蔬（0.16）、杂草（0.09）、枯枝（0.35）及秸秆（0.26），说明蛋白类物料在堆肥过程中富里酸分子量的增加量明显高于纤维素及木质素类物料。

（5）SUVA₂₉₀

紫外光谱参数SUVA₂₉₀能够表示堆肥过程中醌基的含量^［22］。如图1-6（e）所示，鸡粪、牛粪和污泥中醌基含量在堆肥过程中持续上升，说明蛋白类物料中胡敏酸中醌基含量逐渐增多；而醌基含量在果蔬、杂草、枯枝及秸秆中则呈先升高后降低的趋势，这是由于在堆肥后期，纤维素、木质素类物料中游离的醌基之间或与活性自由基发生缩合，形成胡敏酸从而减少了醌基的含量^［1，8］。

图1-7（e）为不同物料堆肥过程中富里酸中醌基含量的变化趋势，与胡敏酸不同，堆肥过程明显增加了富里酸中醌基的含量，不同物料增加量从大到小依次为：枯枝（0.06）>秸秆（0.16）>杂草（0.20）>果蔬（0.28）>污泥（0.34）>牛粪（0.40）>鸡粪（0.17）。由此可见，木质素堆肥过程中醌基的增加量最高，其次为纤维素类，蛋白类物料最低。研究表明，堆肥过程中木质素降解产生芳香碳，芳香碳能进一步氧化成醌基，这些醌基与氨基酸等缩合形成胡敏酸与富里酸^［8］，因此，物料差异对堆肥过程腐植酸中醌基含量影响较为显著。

1.2.2.2　堆肥胡敏酸与富里酸的荧光光谱特征

为研究堆肥过程中腐植酸的组成结构与变化规律，采用平行因子分析方法对胡敏酸及富里酸的荧光光谱进行解析。堆肥腐植酸由4个荧光成分组成，如图1-8所示，根据已有文献表明，C1［（E_m/E_x）/nm，410/326］为类富里酸物质^［23］；C2［（E_m/E_x）/nm，350/（215，280）］与C4［（E_m/E_x）/nm，300/（225，275）］为类蛋白类物质，其中C2为类酪氨酸类物质^［24］，该峰不仅与酪氨酸类物质相关，还与可溶性微生物代谢副产物和苯环类物质有关^［25］，C4为色氨酸类物质^［26］，它们既可以以游离态存在，也可以与蛋白质结合；C3［（E_m/E_x）/nm，465/（275，365）］为类胡敏酸物质^［27］。

基于荧光光谱-平行因子分析，根据荧光组分得分值F_max变化，得到胡敏酸、富里酸在堆肥过程中结构及组分的变化（表1-1）。根据EEM-PACAFAC结果可知，在堆肥的升温期，类色氨酸组分（C4）含量最高，随着堆肥的进行该荧光组分所占比例有所降低（鸡粪与牛粪中胡敏酸除外），而类富里酸物质（C1）与类胡敏酸的荧光组分所占比例呈增加趋势。这是由于色氨酸类的微生物可利用性较强，随着堆肥进行，胡敏酸与富里酸中类蛋白类组分随微生物降解其百分含量逐渐降低，逐渐转化为类富里酸和类胡敏酸类物质^［28］。鸡粪与牛粪在堆肥腐熟期形成的胡敏酸中仍含有类蛋白类组分，并且类胡敏酸与类富里酸的含量无明显增加，说明此蛋白类物料中胡敏酸的腐殖化程度相对其他物料较低。类富里酸与类胡敏酸是结构较为稳定的组分，这源于堆肥过程微生物对木质素与纤维素类物质的降解^［29］。类酪氨酸类物质（C2）在堆肥过程中无明显变化。

1.2.2.3　堆肥腐植酸的核磁共振波谱特征

（1）¹³C-NMR（¹³C-核磁共振）波谱

为比较胡敏酸不同碳核分布，将扫描光谱分为以下4区：0～50ppm（1ppm=10^-6，下同）为脂肪碳（¹³C-NMR1）；50～110ppm为多羟基碳（¹³C-NMR2）；110～160ppm为芳香碳及酚类碳（¹³C-NMR3）；160～220ppm为羧基碳（¹³C-NMR4）^［30］。7种物料堆肥过程中胡敏酸的¹³C-NMR波谱如图1-9所示，根据其图谱出峰位置与形状可将7种堆肥胡敏酸分为两类：鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、枯枝、秸秆与污泥。7种堆肥在0～50ppm范围内均呈现一系列的共振信号，如在18ppm、22ppm、29ppm、40ppm、45ppm均有清晰可见的吸收峰，这可能是由于—CH₃、—CH₂等基团片断的吸收引起的^［31］。在50～110ppm范围内为多羟基碳、连氧碳和连氮碳的特征吸收^［32］，从图中可以看出，堆肥过程中存在大量的羟基碳与氨基酸，它们也是腐植酸形成的重要功能基团。110～160ppm范围内的共振信号是7种堆肥过程中共有的特征吸收峰，表明这7种堆肥胡敏酸都含有芳香碳及酚类碳。在170～185ppm之间的共振吸收是酯、羧酸、醌、酮中羰基碳的贡献^［33］，普遍存在于7种堆肥过程中。研究表明，虽然受NOE（欧沃豪斯）效应饱和作用的影响，谱峰面积与其所代表的含碳数不完全成正比，但在相同条件下，记录的质子噪声去偶碳谱可定性地比较不同堆肥过程中胡敏酸中碳的相对百分含量^［34］。

如表1-2所列，7种物料胡敏酸中的脂肪族碳含量随堆肥过程呈递减趋势，而芳香碳与酚类碳含量则呈升高趋势。这说明堆肥过程中，脂肪族基团逐渐被微生物降解，而胡敏酸结构单元逐渐形成。其中，胡敏酸中脂肪族含量按照鸡粪、牛粪、污泥、果蔬、杂草、秸秆及枯枝的次序递减，分别降低了18.5个百分点、17.4个百分点、13.45个百分点、9.13个百分点、6.34个百分点、5.42个百分点和0.10个百分点，说明蛋白质类物料中的脂肪碳的降低量最多，其次为纤维素类物料，这是由堆肥中脂肪族碳初始含量的差异引起的。多羟基碳在不同物料堆肥过程中变化趋势并不一致，其中鸡粪、牛粪在堆肥过程中多羟基碳呈降低趋势，分别降低了7.33个百分点、3.42个百分点，而果蔬、杂草、枯枝、秸秆、污泥堆肥中则分别增加了15.36个百分点、5.25个百分点、1.14个百分点、6.51个百分点、5.41个百分点。这说明蛋白类物料中胡敏酸的芳香碳与酚基碳主要源于脂肪族碳与羟基碳的降解，而纤维素与木质素类中芳香碳主要源于脂肪族碳的降解。不同物料芳香碳含量均有不同程度的升高，鸡粪、牛粪、果蔬、杂草、秸秆、枯枝、污泥分别升高了16.6个百分点、17.1个百分点、12.2个百分点、21.8个百分点、15.6个百分点、5.0个百分点、5.0个百分点。不同物料中羧基碳含量变化趋势不同，其中，鸡粪、牛粪、污泥的胡敏酸中羧基碳分别增加了9.3个百分点、3.8个百分点、3.0个百分点，而果蔬、杂草、枯枝、秸秆分别降低了18.4个百分点、20.7个百分点、6.1个百分点、16.70个百分点。表明纤维素与木质素类物料更易发生芳基化，而羧基化普遍存在于蛋白类物料的胡敏酸形成过程中。

（2）¹H-NMR波谱

7种堆肥过程中富里酸的¹H-NMR波谱如图1-10所示。¹H-NMR的化学位移主要分为3个区^［35］。

①0.5～3.1ppm范围内的吸收主要是脂肪链上氢的贡献，图中可明显看到此范围内的吸收峰，其中δ=0.80ppm、0.86ppm、0.87ppm的吸收峰为脂肪键上甲基的吸收峰；δ=1.21ppm、1.22ppm、1.24ppm的吸收峰为亚甲基、距离芳香环两个碳以上的CH或极性官能团的吸收峰。

②3.1～5.5ppm区，该区为连氧（或氮）碳上的H（主要为多糖、有机胺、含甲氧基类物质）以及脂环芳族H的吸收，富里酸在堆肥过程中均呈现出宽而强的共振信号，并且在4.50～4.75ppm处有尖锐强峰，该范围内的吸收可能是样品中—OH、—COOH、NH等活泼氢及溶剂中微量水造成的^［36］。

③富里酸在6.0～10.0ppm范围内可观察到形状各异的共振信号，该范围为芳香族化合物中H的信号，包括醌、苯酚、含氧或含氮或含氮杂环芳香化合物、甲酸盐及其他具有空间位阻的芳香氢的贡献^［37］。

本研究中各组分在3个化学位移区均存在不同程度的吸收，根据图1-10各吸收区域的峰的面积，计算了各类氢的相对含量，结果列于表1-2。化学位移在0.5～3.1ppm范围内的含量呈现出明显降低趋势，鸡粪、牛粪、果蔬及污泥分别降低了50.7个百分点、37.6个百分点、21.4个百分点及21.9个百分点，而枯枝、杂草、秸秆在堆肥过程中的变化量小于10个百分点。部分物料在3.1～5.5ppm区间的百分含量呈现出先上升后下降的趋势。在高温期，鸡粪、牛粪、污泥含量分别升高了20.3个百分点、29.6个百分点、26.5个百分点，其次为果蔬（2.9个百分点）与杂草（9.4个百分点），而枯枝与秸秆与之相反。由此可以推测，在鸡粪、牛粪与污泥中升高的这一部分碳水化合物、含氧甲基类物质的含量是脂肪族链上氢的断链而形成的^［38］；而枯枝、秸秆、果蔬、杂草中脂肪族氢含量在升温期含量较少，转化量低，到达腐熟期才呈现出明显的降低趋势。7种物料中富里酸在6.0～10.0ppm范围内的含量均有明显升高，分别升高了61.3个百分点（鸡粪）、71.5个百分点（牛粪）、76.6个百分点（果蔬）、35.8个百分点（杂草）、50.4个百分点（枯枝）、70.7个百分点（秸秆）及47.9个百分点（污泥），说明堆肥过程中随着脂肪结构及聚亚甲基链结构的破坏，一部分生成了醌基，苯酚及含氧、含氮等杂环芳香化合物^［39］。