1.4 高速逆流色谱
高速逆流色谱法（HSCCC）是20世纪80年代初，由美国国立健康研究院（NIH）的Ito博士首创的一种不用任何固态载体的新型液-液分配技术[3]，可以在短时间内实现高效分离和制备，尤其因极高的分离效率及程序化分离模式而被日益广泛地应用于天然产物的分离提纯，高速逆流色谱正在成为天然产物分离提纯领域中的程序化制备技术。
1.4.1 高速逆流色谱概述
高速逆流色谱法是利用螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合，产生一种独特的动力学现象，使两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配与传递。当仪器工作时，互不相溶的两相溶剂在螺旋管内具有单向性流体动力平衡性质，如果一相溶剂作为固定相，则另一相作为流动相载着样品穿过固定相，两相溶剂在螺旋管中实现高速的接触、混合和传递，由于物质各组分在两相间分配系数的不同，导致在管内的移动速度不同，从而实现样品分离。图1-1所示的是实现高速逆流色谱的螺旋管行星式离心分离仪的设计原理[4]。图1-2所示的是螺旋管中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。HSCCC技术因其连续高效，回收率高，制备量大等特点，可直接分离制备中药粗提取，化合物的分离仅依赖于其不同的溶解性能，不存在因不可逆吸附造成样品损失和因表面化学等因素引起被分析物变性等缺点，在各分离提纯领域中的应用越来越多，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域，已成为一种备受关注的新型分离纯化技术。
图1-1 实现高速逆流色谱的螺旋管行星式离心分离仪的设计原理
图1-2 两溶剂相在运动螺旋管内的流体动力学特征
1.4.2 高速逆流色谱的原理
溶剂系统的选择和优化是逆流色谱分离工作的难点，也是样品能否成功分离的关键。一般来说，选择用于高速逆流色谱仪的溶剂系统时，应注意以下几点：不造成样品的分解或变性；足够高的样品溶解度；样品在溶剂系统中合适的分配系数值，一般在0.5～2.5之间；固定相能实现足够高的保留；溶剂易挥发以方便后续处理[5]。
HSCCC的溶剂系统的选择通过文献寻找同类化合物的分离实例，大致圈定溶剂系统的组成。表1-1根据被分离物质的极性，列出一些基本的可供参考的溶剂系统。通常应用HPLC来测定溶质的分配系数。具体方法为：将样品溶于一定体积的某一相中（例如上相U），然后利用HPLC测定上相溶液，得到色谱峰面积AU1；随后，加入一定体积的另一相（例如下相L），充分振荡达到两相的分配平衡后，取该溶液的上相进行HPLC测定，得到色谱峰面积AU2，如图1-3所示。根据公式计算出分配系数：
图1-3 分配系数K的HPLC测定方法
表1-1 高速逆流色谱常用的基本溶剂系统
1.4.3 高速逆流色谱的工作步骤
① 溶剂系统的准备 通常要在使用前将确定的溶剂系统配制好，并使两相溶剂平衡充分，避免在运行过程中产生气泡。配置好的溶剂系统最好在使用前将两相分开，将分开的溶剂系统的上、下相放置于密闭的容器储存。
② 柱系统的准备与运行 运行前进行仪器的检查，然后开机。在仪器不旋转的状态下，以较高流速将固定相泵入螺旋管柱内。然后按照设定的仪器转向（正转或反转），调节转速，使之达到设定的速度，开启溶剂泵的开关，以一定的流速泵入流动相。当溶剂体系建立了流体动力学平衡时，即可进行下一步的进样操作。
③ 样品溶液的制备和进样 待分离样品通常是用上、下相的混合溶液来溶解。当样品量比较少时，可用上下相任何一相来溶解；当样品量比较多时，通常要用适量等体积的上、下相混合溶液来溶解。待溶剂系统建立了流体动力学平衡后，即可通过进样阀进样。这种方法类似于普通硅胶柱的湿法上样。还有一种类似于普通硅胶柱的干法进样的方法，是在固定相注满分离柱后，紧接着上样，然后再使之转动，同时启动溶剂泵，这样就使得样品随流动相一同进入分离柱。流动相溶剂前沿出现时的体积等于柱中固定相被推出的体积。这种进样方法常被用于pH区带精制逆流色谱中。
④ HSCCC分离 进样后，进入HSCCC分离的过程，在HSCCC操作中除了正常的洗脱方式外，进行HSCCC分离时，还能采用步级式洗脱和梯度洗脱。因此，为了获得成功的分离，需要对溶剂系统进行特别的选择：造成梯度的物质如酸、中性盐等，应几乎完全分配到流动相中；同时，不能让管柱里的两溶剂相的体积比发生明显的变化。
不论采用何种洗脱方法，在这种分离实验中，采用首到尾端的洗脱方式总能给出较好的分离结果。对于某些溶剂系统来说，尾到首端的洗脱方式会导致一定的固定相流失，从而使峰形分辨度降低。尽管这种流失不严重和对分离结果影响不大，但是，流失的固定相水滴会被吸附在检测器的流通池壁上，形成对于溶质吸收峰的“噪音”干扰。
⑤ 清洗分离柱 当HSCCC一次分离完成时，停止流动相的泵入，可以利用氮气瓶或者空气压缩机将分离柱中的液体吹出，并收集这些排出液来测定固定相的保留率[R＝（V总－V下测）/V总]。吹出的固定相，往往含有对固定相有极强亲和力的成分，也就是分配系数高的成分，不能轻易扔掉。吹出柱内溶剂的分离柱要用乙醇清洗一次，以避免残留物对下次分离工作的干扰和影响。