Chapter 2　Pathogenesis of Coal-burning Type of Endemic Fluorosis

Coal-burning fluorosis is a kind of endemic fluorosis happening uniquely in China.The clinical symptoms and X-ray signs of coal-burning fluorosis is basically the same as drinking water fluorosis.However, there are differences in the source of fluoride intake and many influencing factors for coalburning type as compared to drinking water type.Therefore, the pathogenesis of coal-burning fluorosis has something in common with that of drinking water type but also has its unique characters.In the past decades, researchers have carried out basic research on the pathogenesis of coal-burning fluorosis by f i eld epidemiological investigation, animal models and cell experiments.The results of these studies preliminary revealed that the pathogenesis of coal-burning fluorosis are related to enamel protein and its molecular regulation signaling pathways, bone-related biomacromolecule signaling pathways, genetic factors, oxidative stress and apoptosis, ect.

第一节　骨相损伤的发病机制

一、氟斑牙发病机制

对氟斑牙发病机制研究概括起来有以下几种假说：在釉质中，氟作用于矿化组织，扰乱了矿化的进程；氟促使成釉细胞凋亡，从而干扰了釉基质的合成、分泌以及成釉细胞的增殖和终末分化，并且氟可以影响矿化微环境中的钙离子浓度，干扰矿化进程；氟导致釉质成熟期间釉质中的基质蛋白，特别是釉原蛋白的水解和移出延迟；生物个体基因型的不同以及遗传变异对氟的易感性影响。近年来的研究多集中在氟导致釉原蛋白水解和移出延迟方面。

成釉细胞的发育经历分泌前期、分泌期、转换期、成熟期等阶段，从分泌期开始就不断分泌釉基质，主要包括釉原蛋白和釉蛋白两大类。在釉质发育成熟和矿化过程中釉原蛋白将被蛋白酶分解并被吸收。而釉原蛋白一旦过量储留在基质中，将影响磷灰石的生长，釉质就不能发育成熟和充分矿化。氟暴露情况下，釉基质蛋白水解、清除障碍，使成熟期釉质中蛋白质潴留，阻碍羟基磷灰石晶体的形成，导致牙齿釉质出现多孔性和低矿化的特征性改变。

氟引起基质釉原蛋白滞留的具体机制还不完全明确，研究成果主要集中在以下几个方面：

（一）氟对牙齿发育各期成釉细胞的实质性损害

动物实验表明，煤氟的摄入对动物成釉细胞发育的四个时期有不同的影响，造成内质网、线粒体、Tomes突、溶酶体等细胞器的变化。另外，氟降低成釉细胞内G蛋白与粗面内质网和高尔基体的结合，这可能是导致成釉细胞内蛋白转运障碍的原因。

（二）氟对釉基质蛋白及蛋白酶的影响

氟对釉基质蛋白的影响目前还存在争论。大多数实验都显示釉基质分泌总量减少，但也有研究表明，在高氟饮水地区的人牙釉质中的蛋白含量高于正常釉质中的蛋白含量，说明高氟暴露影响了釉基质的合成、分泌与水解、清除。成釉细胞在其发育的转换期和成熟期分泌基质金属蛋白酶20（matrix metalloproteinase-20，MMP-20）和激肽释放酶4（kallikrein-4，KLK-4），在MMP-20、KLK-4的共同作用下，基质蛋白被降解，基质降解所留下的空隙为釉质晶体生长提供空间，Ca、P等元素沉积在长大的釉质晶体表面，使釉质矿化，最终成为矿化程度极高的硬组织。在牙釉质的形成和矿化过程中，氟化物能损害釉质发育各期的牙胚成釉细胞，通过影响成釉细胞在发育的不同时期所分泌的釉基质蛋白及酶类的合成、分泌及水解，导致釉质的成熟缺陷。已有研究表明，煤氟的摄入能影响成釉细胞成熟期KLK-4的表达，进而可能影响釉质的矿化成熟。此外，蛋白酶的激活和稳定性的维持需要Ca2+参与，过量氟可通过降低釉基质中的Ca2+浓度而间接干扰蛋白酶的活性。

（三）氟对釉基质pH的影响

成熟期的成釉细胞发生光滑缘成釉细胞和纹状缘成釉细胞间的循环转换时，可以造成细胞外环境的局部pH变化。有研究表明，光滑缘成釉细胞周围的釉基质pH为7.2左右，而纹状缘细胞周围的pH约为6.2。由于釉原蛋白的溶解度和蛋白水解酶的活性与周围pH值的变化密切相关，所以，光滑缘成釉细胞和纹状缘成釉细胞间的循环转换可以不断地调整釉基质中的pH，来控制釉原蛋白的水解。氟可以减少这种循环转换的次数，降低釉原蛋白的溶解度，改变釉质蛋白水解酶最适pH，并影响蛋白水解酶的活性，降低蛋白水解酶作用的时间，造成蛋白水解的障碍，从而使蛋白潴留。另外，当高浓度氟进入成熟期釉质中时，釉基质的羟基磷灰石会转化为氟磷灰石，在反应进行的同时，pH升高，也会导致釉原蛋白的水解延迟。

（四）氟影响了釉质中的钙离子浓度

大量的氟进入机体后，由于氟对Ca2+的高度亲和力，二者结合成氟化钙，导致游离的Ca2+浓度下降。而Ca2+依赖性细胞黏附分子——钙黏附素，在同型细胞间的黏附中起重要作用，钙黏附素缺乏可能是成釉细胞排列疏松、紊乱的原因。成釉细胞不能紧密排列，缺乏相互间互相识别的信号，因而导致釉质发育紊乱。同时，稳定的Ca2+也是基质蛋白酶活性稳定的保障，在Ca2+浓度下降的情况下，也会影响到相关酶类的活性，进而影响基质蛋白的降解。

（五）氟对成釉细胞信号通路的影响

从现阶段国内外的研究进展来看，目前发现的主要机体代谢、应激、凋亡等调控机制，在一定浓度氟的作用下几乎都有可能发生某种程度的变化。牙胚的发育过程是成釉细胞和成牙本质细胞分化、牙齿硬组织形成的过程。转化生长因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成员作为信号分子，参与早期的牙胚发育和细胞外基质形成。Smad是TGF-β细胞内信号传导的相关蛋白，是TGF-β受体作用的直接底物。氟可以降低TGF-β/Smad信号通路各因子的表达，干扰上皮和间充质之间正常的信号转导，进而抑制了造釉细胞和成牙本质细胞的分化及随后的基质合成与分泌，这可能是氟斑牙发生的细胞内机制之一。氟可能通过影响成釉细胞内质网功能而导致蛋白合成障碍。高氟暴露后，成釉细胞内质网应激反应关键因子免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulbin binding protein，BiP）和细胞生长抑制与DNA损害诱导蛋白153、45α（growth arrest and DNA damage-inducible proteins，GADD153/CHOP，GADD45α）表达上调，引起成釉细胞DNA断裂和细胞凋亡；氟还能激发成釉细胞的蛋白激酶受体样内质网激酶（protein kinase receptor-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇需要酶1α（inositorequiring kinase 1α，Ire1α）以及激活转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）通路，由此干扰了分泌期成釉细胞的功能，从而导致氟斑牙的发生。此外，过量氟的摄入可以诱导成釉细胞的凋亡，从而影响成釉细胞的正常分泌功能。

（六）生物个体基因型的不同对氟的易感情况

大量研究表明，同样的生活环境、同样氟接触水平的人群，不同个体患氟斑牙与否及其氟斑牙的程度有很大的差别，可能与基因背景因素和个体对氟的敏感性的差异有一定的相关性。成釉蛋白基因（ameloblastin，AMBN）是牙胚发育特异性基因，在釉质成熟和矿化过程中起到重要的作用。在对燃煤型氟中毒病区的患者与对照组的比较研究中发现，AMBN基因7号外显子538540delGGA和13号外显子986C>T位点多态性可能是影响氟斑牙发病的易感性因素之一。降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）AluⅠ位点基因型CT+TT是燃煤型氟中毒地区人群的易感基因型，CTR基因的多态性可能影响牙齿矿化过程中离子的代谢，从而导致在相同氟水平条件下氟斑牙的发生情况不同。维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）是维持机体钙磷和骨代谢平衡、细胞分化以及免疫反应方面的重要蛋白，在燃煤型地方性氟中毒病区携带VDRBsmⅠ位点GG基因型和FokⅠ位点TC和CC基因型的个体发生氟中毒的风险较高，而在饮水型病区的研究却表明该基因多态性与氟斑牙易感性无关，说明VDR基因多态性存在地区差异，并且可能与氟中毒类型及程度有关。此外，氯通道相关因子囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因的多态性可能与氟斑牙的发生存在一定的关系。

二、氟骨症发病机制

氟骨症包括骨硬化、骨软化、骨质疏松、骨周软组织骨化以及软骨和关节的退行性改变，而成骨活跃和骨转换加速是氟骨症进展期的重要特征和形成骨病变多样性的病理基础。在过量氟的作用下，与骨转换过程相关的各种细胞均参与了氟骨症的发病。

（一）氟对成骨细胞的作用

成骨细胞（osteoblast，OB）起源间充质细胞或叫间充质干细胞。过量氟引起的骨病变复杂多样，涉及参与骨转换的各种细胞。其中成骨细胞功能活跃是一个发生较早并起主导作用的环节。无论在体内还是体外培养细胞，过量氟的基本作用是激活成骨细胞，促进成骨活动。国内外学者在氟刺激成骨细胞作用增殖和分化方面进行过一系列研究，发现很多细胞信号通路均参与其中。如PI3K-Akt信号通路、BMP/Smad信号通路、AP1信号通路、Wnt信号通路、PERK信号通路和Twist信号通路。有研究发现，氟能够上调大鼠骨组织或成骨细胞中纤连蛋白和骨粘连蛋白的表达，提示骨非胶原蛋白在氟骨症发生机制中也发挥作用。此外，氟与氧化应激和内质网应激关系密切。过量氟可能通过影响成骨细胞内骨连接素基因的表达和氧化应激状态而改变正常的成骨分化。氟激发成骨细胞的内质网应激反应，并对骨转化基因的表达也产生影响，最终导致成骨细胞凋亡。有关燃煤型氟中毒病区人群流行病学调查和动物实验也表明，过量氟可以导致钙代谢障碍，使血钙降低，而过量氟的摄入可以使成骨细胞内Ca2+的一过性升高，同时影响bFGF、C-fos、C-jun的表达，并且通过影响BMP/Smad信号传导途径、PI3K/Akt信号传导途径激活成骨细胞系。

（二）氟对破骨细胞的作用

破骨细胞（osteoclast，OC），它是一个高度分化的、具有多个核的大细胞（直径30～100μm）。OC在骨吸收与骨再建中起启动作用，并在局部微循环中通过分泌酸及溶酶体使骨矿物质溶解及骨胶原降解。骨质疏松合并骨质硬化是氟骨症特征病理改变之一，在氟骨症发生发展中，OC功能活跃和破骨性吸收增强在骨质疏松的病变中起重要作用。破骨性吸收增强和骨转换加速，促进氟骨症向骨质疏松和骨软化的方向发展。在影响氟中毒发生的众多激素中，甲状旁腺激素（parathyroid hor-mone，PTH）对OC的刺激作用最强。低血钙引起继发性甲状旁腺功能亢进，PTH分泌增多。超生理剂量的1，25（OH）2D3对OC也起活化作用，与PTH在促进破骨性吸收方面互相协同。在骨组织微环境中，C-fos、骨保护蛋白配体（osteoprotegerin ligand，OPGL，又称破骨细胞分化因子）对破骨细胞的影响甚大，多种激素或细胞因子对OC的作用需通过调节OB分泌OPGL、OPG和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）发挥其对破骨细胞的作用。氟化物也可通过上调OB中OPGL mRNA和M-CSF mRNA表达水平，并通过调节MMPs和TIMPs的表达促进破骨性吸收。还有研究表明，过量氟暴露能够刺激成骨细胞过量分泌破骨细胞形成必需的RANKL，并且在不同浓度RANKL条件下，氟对破骨细胞形成作用有差别，在较低浓度（50ng/ml）时氟能显著抑制破骨细胞形成，当浓度提高至100ng/ml时，氟反而对破骨细胞生成有轻微刺激作用。氟能调节破骨细胞中活化T细胞核因子（nuclear factor of active T cells，NFAT）c1的表达。体外研究表明，氟能通过抑制NFATc1及其下游基因的表达而使破骨细胞活性降低；而在对氟中毒大鼠模型的研究中发现，低氟暴露大鼠破骨细胞中NFATc1蛋白及mRNA表达均升高，而高氟暴露大鼠破骨细胞中NFATc1蛋白及mRNA均呈下降趋势。说明NFATc1参与氟骨症的发生，但具体机制有待进一步研究。

（三）氟对骨、软骨中细胞基质的影响

正常骨组织由骨基质和骨细胞构成。骨基质为细胞生存的外环境，也称为细胞外基质（extracellular matrix，ECM），由4种成分组成：胶原蛋白（collagen）、蛋白多糖（proteoglycan）、弹性蛋白（elastin）及结构糖蛋白（structural glycoprotein）。过量氟对骨组织ECM的影响是其干扰骨代谢的重要组成部分。骨组织中的ECM主要是由成骨细胞合成和分泌的，转过来又能对细胞功能发挥重要影响。氟中毒时成骨细胞功能活跃，形成未成熟的编织骨，其胶原的结构、排列明显不同于成熟的板层骨。骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）是一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，其主要与羟磷灰石结合，介导细胞黏附于骨表面，与羟磷灰石核心形成及骨再建过程有关，在新形成骨及骨再建活跃部位高表达，调控未分化细胞向活性成骨细胞分化，对成骨细胞的趋化、黏附和分化及基质的矿化有重要作用。骨生物学研究已证实，BSP是骨转换过程中的一种重要的骨细胞外基质非胶原蛋白。已有研究表明，亚慢性过量氟暴露对大鼠骨组织中BSP表达水平有影响，并且BSP的表达水平与骨氟含量间存在着明显的正相关关系，说明BSP可能在慢性氟中毒的病理性骨转换过程中发挥促进作用。同时，过量氟影响破骨细胞的功能，促进破骨细胞分泌一些溶酶体酶，主要包括一些酸和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）而促进基质的降解，导致骨转换过程加速。体内和体外研究均表明，氟中毒时，破骨细胞能通过提高MMP-9的活性来增强破骨性骨吸收，促进骨转换过程加速。

（四）表观遗传学改变与氟骨症

DNA甲基化转移酶1（DNA methylation transferase 1，DNMT1）是维持甲基化的主要参与酶，也是外源化学物引起DNA甲基化的重要靶点，其蛋白高表达可使DNA甲基化修饰率提高，细胞异常增殖而导致疾病。在燃煤型氟中毒人群的研究中发现，DNMT1参与氟中毒的发生发展过程，其转录及蛋白表达增强可能是氟骨症发生的早期分子事件。

第二节　非骨相损伤的发病机制

地方性氟中毒不仅能够造成牙齿、骨骼等硬组织的广泛损伤，还可引起全身软组织不同程度的损害，其非骨相损伤具有明显的多样性，但其发生的具体机制很可能不尽相同。相对来说，其共性是实质细胞的退行性改变，而大多不伴有明显炎症反应，除超大剂量可导致明显的细胞坏死外，多数情况下属于细胞凋亡。过量氟可引起染氟机体非骨相组织的氧化应激反应、促使细胞凋亡是目前研究关注的热点。

一、氟对神经系统作用的机制研究

氟和其他卤族元素一样能够透过血脑屏障进入脑组织，机体如果长期摄入氟，过量的氟可在脑内蓄积，进而影响到神经系统的正常生理功能。以往研究证实，中、高水平的氟暴露能降低儿童的智力水平，氟摄入剂量与儿童智商呈现出一定的负相关趋势。而较低饮水氟暴露（1.3mg/L±1.05mg/L）时，7～14周岁儿童的智力与尿氟水平和氟斑牙患病程度也呈显著负相关，说明低氟暴露对神经系统有损伤作用。在对燃煤型氟中毒病区人群的调查中发现，氟暴露不利于儿童的智力发展和生长发育，并且人群血浆中具有神经递质功能的硫化氢表达水平降低，这可能与神经系统损伤有关。

由于针对人群的研究受限于取材，尚缺乏氟对脑等神经器官损伤的病理资料，研究者们利用氟中毒动物模型观察了氟对脑组织形态学的作用。动物研究表明，氟可以引起子鼠脑氟含量增高，脑组织重量下降，大脑皮质神经细胞超微结构损伤，大脑皮质细胞凋亡程度增高；氟中毒大鼠海马齿状回星形胶质细胞增多，神经发育障碍；尼氏染色显示氟中毒大鼠海马CA3、CA4区神经元内尼氏小体染色明显变浅；海马CA1区神经元蛋白合成功能下降；中脑黑质TH阳性神经元减少，细胞凋亡数量增多。上述动物实验结果表明，氟对脑组织多个功能区均有损伤作用。

目前，氟对神经系统损伤的机制研究主要集中在氧化应激、神经受体、分子信号转导通路以及细胞凋亡等方面。有学者对氧化应激反应与氟中毒神经损伤的关系进行了研究，动物和细胞实验结果均表明，氟可引起小胶质细胞和大脑皮质神经细胞的氧化应激水平升高。过量的氟可导致一氧化氮生成增多和JNK信号通路激活；线粒体在大脑皮质神经细胞胞体和突触内重分布、融合功能障碍、分裂亢进以及DNA结构受损引起线粒体氧化呼吸链障碍；细胞内钙离子异常蓄积；脑组织内源性硫化氢含量增加等。除了氟对神经系统产生氧化应激外，氟对神经受体和分子信号通路也有作用。有学者发现氟中毒大鼠脑组织和过量氟处理的PC12神经细胞氧化应激水平升高，造成生物膜性脂质构成改变，细胞膜性磷脂和辅酶Q减少，两种主要的尼古丁受体类型与配体的结合能力下降，受体a3、a4、a7亚单位的蛋白表达水平降低，认为这些可能是氟中毒时神经系统功能紊乱的重要分子机制。还有研究表明，氟能降低小鼠和大鼠脑组织胆碱酯酶活性和尼古丁受体蛋白含量，活化转录激活因子ETS样蛋白1，激活ERK/MAPK和JNK信号通路，上调大鼠脑组织海马中晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）、细胞核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）和AKT激酶表达。

二、氟对心血管系统的影响

众所周知，血管壁含有丰富的胶原纤维，而胶原纤维是氟损害的靶器官之一。在地方性氟中毒病区的流行病学调查表明，过量氟摄入与成人高血压发病之间有正相关关系，并且氟能升高血浆中内皮素-1（ET-1）水平；地方性氟中毒病区成人颈动脉粥样硬化的检出率高于对照人群，病变程度也重于对照人群，表明高氟与动脉粥样硬化的发生存在一定的联系，其机制可能与高氟暴露所致氧化应激引起系统炎症和内皮激活有关。由此推测氟与心血管发病有一定关系，氟可能通过引起血管壁损伤参与心血管疾病的发生，其具体作用机制有待进一步研究。

三、氟对肝、肾的影响

肝和肾均为机体主要的新陈代谢器官，它们在机体内氟的代谢过程中具有重要作用。有研究表明，饮水氟暴露浓度超过2mg/L能引起儿童血中肝和肾功能酶谱异常。动物和细胞实验证明，氟中毒大鼠肝细胞超微结构受损，其机制可能是氟引起细胞凋亡以及线粒体DNA损伤，干扰肝细胞DNA合成，造成肝细胞损伤。对肾脏的病理学研究证明，氟中毒大鼠肾小管排列结构无异常变化，但肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞出现空泡样变，且近曲小管上皮细胞有脱落现象。氟能通过升高氧化应激水平、上调肾小管TGF-β1和斯钙素蛋白1表达、干扰肾脏细胞G1/S和G2/M周期进程以及引起线粒体DNA损伤等途径，造成肾细胞损伤。在对燃煤型氟中毒大鼠的研究中表明，染氟大鼠的血清、肝、肾中丙二醛（MDA）含量升高，而SOD活性明显降低，说明氟中毒致机体内氧化系统与抗氧化系统失衡，氧化应激引起的氧化损伤作用在氟致肝、肾毒性中起着重要的作用。在肾脏损害方面，在揭示氧化应激参与作用的同时，还发现氟对肾小管上皮的Ca2+-ATP酶（Ca2+泵）泵活性的影响呈低剂量时兴奋、高剂量时抑制的双相作用，过量氟对钙泵的抑制促进了细胞内Ca2+浓度升高和细胞凋亡。

四、氟对生殖系统的影响

过量氟对人和动物生殖系统均有损伤作用。流行病学调查表明，重度氟中毒病区男性精液的含氟量、不育症患病率、血清中尿促卵泡素（FSH）和黄体生成素（LH）高于轻度氟中毒病区和非氟中毒病区，其精子存活率、精子浓度、抑制素B、血清睾酮以及雌二醇有不同程度的降低，说明过高氟暴露会对男性精子的生成及生殖内分泌造成影响，导致男性生殖能力的下降。动物实验结果表明，氟中毒大鼠血清睾酮降低，睾丸间质细胞和睾丸组织超微结构有明显的损伤。氟中毒大鼠睾丸损伤的机制与氧化应激、睾丸干细胞因子表达降低及细胞凋亡等有关。燃煤型氟中毒大鼠睾丸中MDA含量升高，而SOD活性明显降低，说明氟中毒致机体内氧化系统与抗氧化系统失衡，氧化应激引起的氧化损伤作用在氟致生殖毒性中起着重要的作用。

五、氟与糖尿病之间的关系

动物实验表明，过量氟能刺激大鼠胰岛素的分泌且呈剂量-效应关系，并且氟能够降低大鼠对胰岛素的敏感性。长期处于高氟暴露大鼠，其血糖显著升高，红细胞形态学损伤较为明显，若伴有糖尿病，血糖升高更为明显，血常规改变显著。上述结果均来源动物实验，尚缺乏人群调查资料的支持。

综上所述，燃煤型中毒的病因虽然明确，但其特异性发病机制尚无定论。由于燃煤型氟中毒为我国所特有，从而使研究范围和研究深度上受到限制。虽然，饮水型氟中毒和燃煤型氟中毒氟源和摄入途径不尽相同，但从现有的研究来看，燃煤型氟中毒的发病机制与饮水型氟中毒的发病机制基本一致，其确切机制还有待于进一步研究。

（高彦辉、裴俊瑞、魏玮、张微）

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