第四节　甲状腺乳头状癌的突变和分子检测

PTC是最常见的甲状腺癌，在发达国家占甲状腺癌的80%，占IR诱导的甲状腺癌的90%。PTC是最常见的由立方形柱状甲状腺上皮细胞构成，通常形成围绕纤维血管核心的乳头状结构构成并伴致密的纤维化。细胞核是重叠的，空泡状，淡染，通常被描述为“孤儿安妮眼”样外观，50%PTC有砂粒体。临床过程常是惰性的，至少在年轻患者，98%的人活了10年，与一般人群的生存率相似。颈淋巴结受累不影响预后，虽然甲状腺外和（或）肿瘤结外的肿瘤扩展和放射性碘亲和力损失预测较差的生存。此外，局部淋巴结转移是常见的，而血源性播散是罕见的。PTC有许多变异型，包括传统型、实体型、高细胞型、Warthin样型、嗜酸细胞型、结节性筋膜炎型、微小癌型、巨滤泡型、滤泡型、柱状细胞型、膜包滤泡型、弥漫性硬化膜包型、弥漫性滤泡型和筛状-桑葚型。

PTC发生许多不同的基因突变，其中大多数相互排斥，常与不同的组织学亚型及临床病程相关。目前，还没有限定的突变发生在PTC的亚型（25%），表明可能存在未知的遗传改变或使用的分子测试方法不充分。

BRAF的体细胞突变发生于45%的PTC。BRAF基因位于7q34，由19个外显子组成。它也被称为v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（b-raf-1），具有丝氨酸/苏氨酸激酶的功能。在正常条件下，BRAF是被磷酸化的，被K-RAS激活，导致增加细胞周期蛋白D1～3，MDM2和c-myc水平，通过促进细胞周期，增加生长潜力和细胞凋亡的抑制作用促进肿瘤的发生。组成性激活BRAF基因通常存在于多种恶性肿瘤，包括结肠癌、低级别浆液性卵巢腺癌和PTC。在PTC已确定超过40种不同的BRAF突变，90%的突变涉及T→A颠换突变发生于外显子15的1779位置，引起600残基（V600E）发生缬氨酸→谷氨酸替代。由此产生的突变的BRAF激酶比野生型蛋白激酶活跃500倍，具有GTPase活性，允许激酶组成性活化。甲状腺细胞系和动物模型研究表明，BRAF V600E突变促进基因组不稳定性、去分化、转移、增殖并转化。与无突变甲状腺癌相比，具有BRAF V600E突变的甲状腺癌表现较差的临床过程，同时与甲状腺外扩散、疾病晚期阶段Ⅲ和Ⅳ期、复发、放射性碘亲和力的损失和远处转移有关。BRAF V600E突变更常见于PTC的高细胞型、传统型和滤泡型的变异型，这些变异型表现出极具侵袭性的临床经过。在FC中BRAF V600E突变是罕见的。

甲状腺癌的临床BRAF基因突变检测可通过多种不同的分子生物学技术进行检测。因为V600E突变占多数的突变，许多检测方法特异靶向位置1779的T→A颠换。例如，等位基因特异性聚合酶链扩增反应（allele-specific amplification-polymerase chair chain reaction ASA-PCR）和移动终端检测技术（shifted termination assay technology，STAT）均针对单个碱基对的差异来检测BRAF V600E突变。

又称为放大强制突变系统-PCR和等位基因特异性寡核苷酸-PCR，此种方法用于检测一至几个碱基对变化。ASA-PCR采用多3′末端引物，通常来自匹配野生型或突变型序列的3′末端三个碱基对。突变检测是基于一个扩增的野生型或突变型序列的检测。另外，其他系统也可以采用，如蝎扩增检测技术。由于发生于错配引物模板的Taq DNA聚合酶的低扩增，ASA-PCR可以产生高CP值的扩增产物。此外，检测单核苷酸差异的ASA-PCR要求对野生型和突变型特异性引物非常精确退火温度而优化特异引物退火。

Sapio等采用ASA-PCR检测PTC的BRAF突变。分析43例归档的PTC显示，44.2%发生BRAF V600E突变。没有BRAF突变发生于35例良性病变或FC。当单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP）和DNA测序检测方法与ASA-PCR比较时，PCR-SSCP和DNA测序要求超过40%突变的DNA存在于突变检测体系中，显示相对较低的敏感性，而ASAPCR表现两到三倍的敏感性。

ASA-PCR有缺点，包括要求非常精确的退火温度和在高CP值时为假阳性结果。一个部分地克服这些限制技术是STAT。检测引物的设计是与目标DNA互补的。检测引物3末端结合位点在突变目标碱基前结束。标记的检测引物然后结合于目标序列。然后进行引物延伸反应。如果第一目标碱基出现于野生型DNA中，检测引物不延伸。如果发生任何类型的突变，如点突变、缺失、插入或易位，引物延伸反应将继续通过目标基位置，合成多标记核苷酸。比色法、荧光分析法、化学发光检测系统可以用于量化突变转录本的量。STAT非常敏感，可以检测到1%的突变DNA。

STAT已用于PTC的BRAF V600E突变分析，例如Cohen等采用STAT分析95例手术切除的PTCs和42例相应的细针穿刺样本BRAF V600E的突变。在这项研究中，100ng基因组DNA中分离。携带V600E突变的外显子15通过39个周期的标准PCR被扩增。10μmol/L扩增产物用于STAT分析和自动DNA测序。67%切除的PTC和只有12%的FC检出BRAF突变。49例术前细针穿刺样本，其对应于切除PTCs用于分析BRAF V600E突变。94%有一致性的BRAF基因状态。三个不合格样品，两个细胞稀疏，因此，STAT检测用于细针穿刺样本分析是有用的。在39%明确恶性的细针穿刺样本有突变，占不确定组的16%。因此，STAT BRAF基因检测可用于确定不确定组内的PTC。当STAT检测和DNA测序进行比较时，这两种方法间存在100%的相关性。因此，STAT检测与测序具有相似的准确性和可靠性，且具有更高的灵敏度。

单链构象多态检测已被用于检测甲状腺癌BRAF突变。单链构象多态检测中，野生型和突变的DNA需进行PCR扩增，同时设立已知的野生型对照。DNA样品需要热变性，快速复性，随后进行电泳。一个携带突变的单链DNA片段，即使一个碱基对的变化，将形成不同的二级和三级结构，与野生型对照相比，这将导致不同的迁移模式。SSCP一直运作良好，具有检测单一的V600E BRAF突变的优势，虽然它不识别特异碱基对的改变。它没有ASAPCR或STAT检测敏感，通常在技术上是具有挑战性的。它可用作为初始突变筛选工具，如果初筛是阳性的，可以通过更精确的方法检测。此外，SSCP能使用基因组DNA或RNA，然后进行PCR扩增。构象链凝胶电泳甲状腺BRAF基因突变检测类似于单链构象多态性分析，不经常用于甲状腺BRAF基因突变检测。

在一个大型的多中心研究中，Fugazzola等采用DNA测序和单链构象多态性分析BRAF突变。分离BRAF基因的RNA，通过氡六聚体引物逆转录酶合成cDNA，采用PCR扩增含有V600E BRAF突变基因的cDNA，进行SSCP和直接DNA测序。BRAF V600E突变发现于38%的PTCs，并随着患者年龄的增加，突变频率增加。

DNA测序常用于BRAF基因突变分析。虽然被认为是分子检测的“金标准”，尤其是Sanger测序，直接测序有几个缺点：①它是相对昂贵的，特别是对于较长的序列；②其他技术如ASA-PCR和STAT有更高的灵敏度；③当用于在甲醛溶液固定的组织时，它可能会产生错误的结果。直接测序具有可检测所有可能的核酸序列的优势，因此，可识别ASA-PCR和STAT遗漏的罕见突变。

高分辨率熔解曲线分析（high-resolution melting，HRM）分析dsDNA。最常见的一个包含可能目标突变的特定的核酸序列采用PCR扩增。然后混合荧光染料，如SYBR绿色，当结合dsDNA发出强光而结合ssDNA时发出弱光。扩增的dsDNA随后加热，从dsDNA转换为ssDNA后，随后DNA熔点荧光损失，通常情况下，数据被呈现为熔化曲线的负一阶导数，这样可以更容易地确定解离的确切温度。

Rowe等分析42例甲醛溶液固定石蜡包埋的甲状腺标本，37例PTC，5例良性病变。包含BRAF V600E突变DNA的区域采用PCR扩增。冷却产生的扩增子，然后以0.1℃/s从45℃加热到95℃，通过绘制负导数来确定荧光峰对应的温度。PTC样本中，62.2%有BRAF V600E突变，而良性甲状腺样本无突变。

在这项研究中，当HRM与DNA测序进行比较时，发现100%的一致性。虽然用于BRAF突变检测，没有注意到HRM的敏感性差，至少需要50%的突变DNA。因此，HRM作为一种检测方法是有用的，但需要很纯的肿瘤DNA才能保证检测的准确性。

HRM有几个优点：①经常是有成本效益的，因此，需要大量样本同时检测；②它有一个相对较短的周转时间和较高的精度；③一旦“启动和运行”，检测是相对简单的。HRM的缺点是不确定特殊碱基突变和需要纯浓缩样品。

由于密切相关位于Xq13.3的BRAF2假基因，所以BRAF基因突变检测是复杂的。这两个基因是相似的，需要仔细的设计引物，避免BRAF基因检测过程中假基因被扩增。BRAF2经常在BRAF突变阴性的PTCs表达。此外，它也表达于荷瘤裸鼠的，激活MAPK激酶，可以转化NIH3T3细胞。目前，基因检测不检测BRAF2，但已有研究表明近50%的经典PTC表达BRAF2，未来BRAF2可能会被纳入基因检测。

RET基因，也被称为RET原癌基因，位于10q11.2，有21个外显子，有三个主要的分别含1114，1106，和1072个氨基酸的异构体，编码一个124kDa蛋白。RET蛋白含有结合的细胞外配体的胞外结构域，是一个单一的跨膜结构域和包含酪氨酸激酶的细胞内结构域。RET的生理配体都属于胶质源性神经营养因子家族：peresphin、artemin、neurturin和胶质源性神经营养因子。RET有多种功能；例如，交感神经、副交感神经和肠神经元、肾脏和雄性生殖细胞的发育均需要RET。生殖细胞丧失RET作用能引起结肠先天性无神经节细胞症（Hirschsprung病），而生殖细胞激活RET作用可导致甲状腺髓样癌（medullary thyroid cancer，MTC）或多发性内分泌肿瘤（multiple endocrine neoplasia，MEN/B）。对于PTC，有20%～30%携带RET基因突变。不同于激活BRAF和K-RAS的点突变或在遗传性MTC或MEN2A/B所见到的激活的RET点突变，在PTC中RET基因突变通常激活染色体内和染色体间的重排并且是PTC所独有的。大多数重排是帧融合，发生于具有许多异源供体基因5末端的RET C-末端/酪氨酸激酶结构域，其中90%涉及RET/PTC1和RET/PTC3基因，其来源于 H4（D10S170）基因和NCOA4（ELE1、RFG或 ARA70）基因的分别融合。虽然融合导致组成性RET酪氨酸激酶的活化，但这些RET重排引起肿瘤发生的分子机制尚不完全了解。此外，重排诱导典型PTC的核变化，其见于隐匿性PTC，在转基因小鼠的甲状腺组织中表达时诱导类似人类PTC的甲状腺癌。

实时荧光定量PCR检测RET基因/甲状腺乳头状癌基因重排：RT-PCR可用于检测基因重排，引物可以根据扩增基因融合区域设计。以特征化慢性粒细胞白血病的BCR-ABL融合基因为例，最初的分析步骤是纯化RNA，利用逆转录酶产生cDNA文库。特异的融合可以用PCR扩增，Zhu等在65例冰冻PTC样品中用RT-PCR分析RET/PCT1和RET/PCT3重排。用TRIZOL试剂提取总RNA，利用上标反转录技术构建cDNA文库。应用RT-PCR检测RET/PTC1和RET/PTC3基因融合。使用适当标记的探针进行扩增检测。在PTCs中，22%病例显示RET/PTC重排。比较了标准灵敏度RT-PCR、高灵敏度RTPCR、实时荧光定量RT-PCR、Southern杂交和荧光原位杂交检测RET/PCT1和RET/PCT3重排的能力。高灵敏度检测14例由标准PCR检测RET/PCT重排和12其他病例，检出率是40%。RT-PCR检测12例重排，Southern印迹杂交检测11例重排、FISH检测14例重排。总体而言，14%的PTC重排可被五种检测方法检测。12例PTC存在非克隆重排由高灵敏度RT-PCR检测。在文献中看到不同患病RET/PTC重排部分原因是由于不同的分子检测方法和肿瘤的异质性。其他技术，如DNA测序，也被用来分析这些重排。然而，不同的RT-PCR检测规程是最常用的方法。

H-RAS、N-RAS和K-RAS是GTP酶超家族成员，GTP酶超家族有150多名成员，分为五组：Ras，Rho，Ran，Rab和Arf。此组成员共含有一个保守的G盒基序，短暂的结合GTP，导致激酶活化，诱导下游信号事件，促进细胞存活和增殖。正常情况下，RAS蛋白迅速水解GTP生成GDP，随后激酶失效。发生于密码子12、13和61的一些特定的点突变抑制GTP酶的活性，表现激酶组成活化和致癌性。在10%～20%的PTC发现RAS基因点突变。

多种方法可完成PTC中RAS基因突变的分子检测。例如，Vasko等在10例FA，9例非典型滤泡性肿瘤，10例FC和10例PTC滤泡变异型检测N-RAS点突变。显微切割切片上的肿瘤，提取和纯化基因组DNA，以外显子2中N-RAS为特异引物的PCR扩增。由此产生的扩增子应用373xl测序仪测序。在FA中没有检测到N-RAS基因突变。外显子2 N-RAS突变存在于33%的非典型滤泡性肿瘤、20%的FC和20%的PTC滤泡变异型。Ezzat等用SSCP检测和DNA测序检测在外显子12、13和61的H-RAS和N-RAS点突变。使用100ng的基因组DNA应用PCR扩增这些外显子，DNA热变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。45例甲状腺癌、腺瘤和增生结节中，在1例PTC发现13密码子H-RAS突变，2例PTC和1例FA携带61密码子N-RAS的突变。没有肿瘤携带K-RAS突变。

NTRK1基因也称为TrkA，发现于1q21-22，至少有17个外显子，编码796个氨基酸分子量为140kDa的糖基化蛋白。NTRK1广泛表达于神经和非神经组织，具有神经生长因子受体酪氨酸激酶的功能。根据人口检查数据，5%～25% PTC携带NTRK1基因突变。类似于RET，NTRK1组成性激活相关的基因重排涉及至少三个其他的基因，其在NTRK13′末端融合基因的5′末端，如TPM3、TPR和TFG。所有的重排导致组成性激活酪氨酸激酶活性。一旦激活，NTRK1激活 RAS，RAC，PI3K，MAPK和 PLCγ，导致细胞增殖。

应用多个方法分析NTRK1，应用PCR扩增肿瘤源性反转录的RNA，扩增子测序是一种常用的技术。Beimfohr等采用此技术结合多重PCR技术和Sanger测序检查81例来自于暴露在切尔诺贝利的儿童的儿童PTC。以前所有的肿瘤确定没有RET重排类型PTC1到PTC5。TPM3/NTRK1融合见于五种肿瘤。NTRK1/TPM3见于4/5的肿瘤。与切尔诺贝利儿童肿瘤相比，具有NTRK1/TPM3融合的肿瘤无组织学的不同。与大多数RET基因突变相比，NTRK1重排在切尔诺贝利辐射引起的儿童PTC中的作用较小。目前，在甲状腺癌中临床检测NTRK1/重排突变并非常规进行检测。

c-Met基因位于7q31.2，由21个外显子组成，编码肝细胞生长因子/散射因子受体，具有酪氨酸激酶活性。c-Met先生成170kDa的单链前体，经过翻译后剪切产生一个细胞内部145kDa的β亚基和一个45kDa的细胞外α亚基。c-Met在卵巢癌、结肠直癌、胰腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌与甲状腺恶性肿瘤中过表达。肝细胞生长因子不适当的结合c-Met可增加上皮细胞的生长和分裂，引起上皮细胞增加运动能力和侵袭能力。因此，c-Met的表达可能在PTC获得侵袭转移潜能方面发挥重要作用。

在正常甲状腺或甲状腺非肿瘤性疾病中很少检测到c-Met。在甲状腺癌中c-Met表达增加约100倍，其过度表达与局部疾病的进展和（或）远处转移密切相关。良性甲状腺病变组织的免疫组织化学研究显示c-Met通常位于基膜，偶尔见于细胞质，不表达于顶端细胞膜。在PTC中，研究显示c-Met蛋白的免疫反应见于细胞质和顶端细胞膜，丧失基膜的免疫反应性。在PTC中，c-Met与紧密连接蛋白zona occludens-1共同定位于细胞质/顶膜。这些发现表明在PTC中c-Met表达发生细胞极性的改变，这可能涉及增加过表达c-Met的PTC的侵袭转移能力。c-Met过表达没有增加PTC的Ki-67水平或增加肿瘤细胞的增殖，而在低分化肿瘤中减少或缺失。c-Met在大约77%的PTC和70%的Hürthle细胞肿瘤中过表达。在侵袭性PTC亚型中c-Met的表达明显升高，在高细胞型PTC，其增加的表达与被膜外扩散，骨骼肌肉侵犯与淋巴浸润相关。

目前，c-Met过表达并非临床分子诊断的常规检测。PTC中c-Met的表达应用免疫组化检测、免疫印迹、组织芯片、cDNA表达芯片和实时定量PCR技术作为基础研究检测方法。很有可能，检测c-Met的方法将被研发而应用于c-Met抑制剂的分子诊断。

PTC很少携带p53和CTNNB1基因突变。目前，在PTC中这些基因突变或变化尚无临床分子检测。

Hashimoto甲状腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）可以表现出不同的组织模式，如慢性自身免疫性甲状腺炎的经典型，或HT相关的增生/腺瘤性病变，甚至HT相关的并发甲状腺癌。HT可以结节状，有时有一个或多个大的所谓的“优势结节”，组织学上可有PTC的一些特点，包括核膜不规则，核空亮，体积增加。在某些情况下，鉴别反应性和恶性的形态学改变是困难的。Sadow等检测28例HT优势结节，寻找优势结节内BRAF、RET、K-RAS、N-RAS和H-RAS突变，以及RET/PTC1或RET/PTC3重排。在优势结节内，即使在那些非典型，令人担忧的组织学特征中无BRAF或RAS突变，无RET/PTC重排。BRAF V600E突变仅见于HT合并PTC。因此在HT优势结节不是恶性的，也不是癌前病变，即使HT是非常不典型的，分子检测也可以区分HT和PTC。

PTC的分子检测可以适用于手术切除和细针穿刺（fine needle aspirations，FNAs）甲状腺病变。虽然目前尚未广泛应用于临床，甲状腺的分子检测可用于组织学模棱两可的病例和FNAs不确定或可疑恶性肿瘤的病例。BRAF基因突变分析检测有预后价值。特别是，同时检测RET/PTC基因突变和BRAF V600E基因突变，这涵盖了70%～80%的PTC，对PTC的诊断是有帮助的，尤其是细胞学/组织学的疑难病例，这两个突变是PTC专有的。