第三节 分子标志物的功能研究
大量的研究旨在探索放疗后正常组织反应与不同患者细胞对辐射的功能反应之间的关联。研究终点多采用克隆形成细胞的存活，或被认为与细胞放射敏感性有关的过程，如DSB修复、染色体畸变或凋亡等。
正常皮肤成纤维细胞是结缔组织的功能性细胞，容易在体外生长。因此，研究常以集落形成试验（CFA）中的存活分数（SF）来定量患者成纤维细胞的放射敏感性，预测患者放疗后发生皮下纤维化的风险。一些初步的、小规模的研究表明，二者可能存在相关性。在一项包括31例乳腺癌术后放疗患者的研究（n=31）中，发现该相关性很弱（rs=-0.46）。后来两个较大的队列（病例数分别为79和104）研究，均无法证实SF与放射性所致纤维化或乳房外观变化之间存在显著相关性。上述阴性结果可能并非出人意料，因为在晚反应组织中，成纤维细胞的更新非常缓慢，与上皮组织相比，结缔组织的功能更依赖于细胞的连续更新。正如前面所提到的，成纤维细胞在照射后不发生凋亡，而是过早分化为有丝分裂后发生永久阻滞的收缩性肌成纤维细胞，并持续合成细胞外基质蛋白或α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，ACTA 2）。
有研究探讨了成纤维细胞放射敏感性的替代终点。应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术检测到体外照射后24小时残留的DSB与乳腺放疗患者纤维化之间存在相关性。然而，另一项验证研究并没有证实这一点，尽管应该注意的是，第一个研究纳入了比验证研究更多的有严重反应的患者，并发现残留DSB是一个严重程度的预测因素。但在对头颈部癌症患者进行的一项小规模的研究中，使用恒场凝胶电泳（Cfge）也没有发现二者存在任何关联。两项关于成纤维细胞微核形成的研究发现，在治疗乳腺癌或其他各种癌症的患者中，纤维化与其亦无相关性。
体外培养成纤维细胞过程耗时费力，而外周血淋巴细胞（PBL）则更容易获得。因此，很多研究采用淋巴细胞为模型研究了辐射敏感性的各种终点。虽然淋巴细胞可能不直接参与放疗后的晚期反应，但采用PBL作为模型的理论基础是假设其放射敏感性反应可能代表由基因决定的个体放射敏感性。虽然使用淋巴细胞的克隆源性细胞存活实验作为终点的研究比较少，但早期的研究表明，出现放疗后严重反应的患者，其对低剂量率照射比未照射的对照组和放疗后反应轻微的患者更敏感。一个大样本的前瞻性研究结果显示，测量2Gy照射后的PBL存活分数可以预测宫颈癌患者的晚期放疗毒性风险。而更多的淋巴细胞研究是以DNA损伤修复为观察终点。彗星实验结果（主要反应DNA单链断裂和碱基损伤）表明，2Gy照射后的低修复动力学和较多的残余损伤与高早反应风险相关且存在量效关系，即损伤程度越高则早反应严重程度就越高。在最近的几项研究中使用更敏感的DSB检测方法对γH2AX修复灶检测，也得到了类似的结果，但一些研究并未发现显著的相关性。
在所有研究中，放射治疗敏感和耐药的患者之间的γH2AX水平有很大的重叠，这使得基于这些检测结果进行放射敏感性预测非常困难。造成重叠的原因可能是某个修复缺陷仅在特定亚群的辐射敏感患者中增加其对射线的敏感性。支持上述不同修复缺陷的患者亚群的证据，来自对G2中期和G0期微核实验测量到的肿瘤患者的染色体放射敏感性缺乏相关性。DSB修复和放疗毒副作用风险之间存在关联的支持证据是染色体畸变增加与早期或晚期正常组织反应风险升高相关，尽管有些研究结果显示存在趋势但没有达到统计学意义，甚至未发现相关性。微核试验可以预测乳腺癌放疗患者的晚反应，但不能预测早反应和乳房美容效果下降的发生风险。
越来越多的研究将淋巴细胞凋亡作为量化个体放射敏感性的终点。早期的研究发现，乳腺癌患者与对照组相比，细胞凋亡增加，但与未发生晚期反应的乳腺癌患者相比，两者无显著性差异。Annexin V检测到的凋亡增强与26例乳腺癌放疗患者的晚期毒性耐药有关。最近的一项研究用台盼蓝染色的方法检测了淋巴细胞在2Gy照射后4小时的早期死亡情况，结果发现其与早反应的严重程度显著相关。在过去的十年中，流式细胞仪检测的T淋巴细胞亚群（CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性细胞）细胞凋亡试验受到了广泛的临床关注。在上述辐射诱发淋巴细胞凋亡（RILA）的检测方法中，细胞凋亡是通过DNA荧光染料（DAPI，后来的碘化丙酸丙酯）来检测下降的DNA含量（降解）。在一项大样本研究中（n=399，包括各种肿瘤的放疗患者），接受8Gy照射48小时后的CD8+细胞凋亡与晚反应风险呈显著负相关。但另一项在乳腺癌放疗患者的病例对照研究中，并未证实发生晚反应的患者与未发生晚反应的患者之间存在显著性差异。但该研究使用冷冻淋巴细胞和较小的放疗剂量，并采用前向/向侧散射（细胞大小和粒度，granularity）来检测细胞凋亡。随后的一项较小的研究（n=16）使用来自乳腺癌放疗患者的新鲜淋巴细胞和荧光标记的Caspase抑制剂（FLICA）检测细胞凋亡，也发现平均凋亡分数在两组不同晚反应风险患者中没有差异。而最近一项关于乳腺癌放疗后纤维化风险的前瞻性研究证实了早期的负相关发现，即细胞凋亡频率与晚期反应风险之间的存在相关性。对宫颈癌患者的研究和对前列腺癌患者的两项研究均发现CD4+或CD8+ T细胞的RILA存在相似的关系。有趣的是，RILA与泌尿生殖系统晚反应有关，但与前列腺癌患者的胃肠道晚期毒性无关。
淋巴细胞的辐射反应与放射治疗发生晚期反应的风险成反比，其可能的机制假说有：①照射后淋巴细胞的缓慢凋亡反应可能促进细胞因子的产生，并吸引炎症免疫细胞进入照射组织；②淋巴细胞凋亡减少的患者在放疗前可能存在炎症或免疫活动增加，增加ROS的产生，导致基因组不稳定，成纤维细胞的终末分化，并增加成纤维细胞的风险；③DNA损伤应答的遗传缺陷，如p53途径，可能导致DNA修复减少、凋亡减少、基因组不稳定性增加，以及成纤维细胞的早期终末分化增加。这些假设需要进一步通过研究加以证实。