5 吸烟相关表观遗传学变化研究进展
纵单单 陈平
烟草流行是这个世界迄今所面临的最大公共卫生威胁之一，每年使700多万人失去生命，其中有600多万人缘于直接使用烟草，有大约89万人属于接触二手烟雾的非吸烟者。烟草燃烧时释放的烟雾中含有7000多种已知的化学物质［1］，有多种生物学作用，绝大部分对人体有害，主要包括尼古丁等生物碱、一氧化碳、氰化物、氮氧化物、醛类、苯、多环芳烃、亚硝胺、镍、镉、铬、砷、杂环族化合物、羟基化合物、有机农药等［2］。流行病学调查显示吸烟是心脑血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、骨代谢疾病、糖尿病以及免疫系统疾病等多种疾病的重要致病因素［1］。吸烟所致疾病的发病机制有很多，包括炎症、氧化应激、凋亡、细胞衰老以及表观遗传等因素，众多发病机制并非独立存在，而是相互联系，共同促进疾病的发生发展。本文将就吸烟对表观遗传学的影响进行论述。
表观遗传学是指不涉及DNA 序列改变的基因或者蛋白表达的变化，并可以在发育和细胞增殖过程中稳定传递的遗传学分支学科，主要包括DNA甲基化、 组蛋白修饰和非编码RNA 等调控机制［3］。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一。大约50%的编码基因在其启动子区存在丰富的GC二核苷酸序列，又称CpG岛。真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBPs）和DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。在真核生物中，约80%的CpG 都被甲基化［4］，未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，其组成单位为核小体。一个核小体由两个H2A，两个H2B，两个H3，两个H4组成的八聚体和147bp缠绕在外面的DNA组成。组成核小体的组蛋白的核心部分状态大致是均一的，游离在外的N-端则可以受到各种各样的修饰。组蛋白的翻译后修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰的过程。组蛋白修饰会影响染色质结合和基因表达。MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与messenger RNA（mRNA）的3’端非编码区结合诱导mRNA降解或抑制蛋白转录。MiRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基pri-miRNA经过一次加工后，成为由70个碱基大小形成发夹结构的microRNA前体，即pre-miRNA；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24bp的成熟miRNA 。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因，miRNA的表达改变与疾病的发生密切相关。不同表观遗传调控模式之间存在交互作用，并且都可能是外源化学物的作用靶点。
一、吸烟与DNA甲基化
DNA甲基化与吸烟密切相关，是吸烟相关性疾病的重要发病机制之一。吸烟可以引起人体多种基因发生高甲基化，导致基因转录调控发生改变，使得人体疾病易感性增加。基因启动子区正常情况下甲基化程度较低，启动子区发生高甲基化不仅能导致该基因表达下降或沉默，而且能通过调节细胞周期、增殖及凋亡参与多种疾病过程。多项研究演示，吸烟会导致肺癌组织、健康人唾液中p16基因甲基化频率增高［5］。在COPD人群中发现外周血白细胞内多种基因的甲基化程度明显升高［6］。哺乳动物基因甲基化主要受DNMT调节。DNMT1——持续性DNA 甲基转移酶是哺乳动物DNMT的主要类型，能维持绝大部分基因的甲基化水平，过表达 DNMT1后，基因的甲基化水平明显上调。研究发现吸烟的腺癌患者肺组织中DNMT1表达较非吸烟肺腺癌人群明显升高［7］。此外，香烟烟雾提取物能上调膀胱肿瘤细胞内DNMT1的表达，并引起基因高甲基化改变［8］。因此，吸烟可以通过上调机体DNMT1表达，引起基因甲基化，导致基因表达改变，影响细胞命运，最终参与疾病发生。
吸烟可以导致内外源性氧化剂负荷量超过机体抗氧化能力，引起氧化/抗氧化失衡，导致疾病的发生。研究发现，在这一过程中DNA甲基化发挥了重要作用。吸烟可以通过氧化应激上调DNMT1的表达及活性，诱导DNA启动子区甲基化，进而影响基因的表达［9］。体外实验亦表明，增加ROS负荷能通过上调细胞内DNMT1表达导致基因出现高甲基化改变，而在抗氧化干预后，DNMT1表达及基因甲基化水平均回落［10］。吸烟引起的DNMT1表达增加以及DNA高甲基化，参与了机体炎症的发生。研究表明吸烟所致的多种基因高甲基化，如RUNX3，JAK3和KRT1等，与吸烟患者血液CRP水平升高有关［11］。此外，DNA甲基化与吸烟诱导的细胞凋亡亦密切相关。大量体内外研究证实吸烟可以引起气道上皮细胞、肺泡间隔细胞以及肺血管内皮细胞凋亡并参与COPD的发病机制。我们的前期研究发现mtTFA、COX-Ⅱ以及bcl-2等多种基因甲基化与吸烟所致的肺血管内皮细胞凋亡有关，而给予去甲基化干预则可显著改善肺血管内皮细胞的凋亡情况［12-14］。综上所述，吸烟可以影响DNA甲基化状态，并通过多种机制引起疾病的发生。
二、吸烟与组蛋白修饰
1.吸烟与组蛋白乙酰化
组蛋白乙酰化是一种可逆的动态过程，主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）协调进行。HAT促使染色体的解聚，激活转录；而HDACs则封闭DNA，抑制转录过程。在正常生理状态下，HAT与HDACs对组蛋白乙酰化作用的调控处于平衡状态。而细胞在发生转化的状态下，HDACs的活性明显增强，使得原有的基因表达平衡状态被打破，导致一些影响细胞增殖和调控细胞周期的分子表达失衡，进而导致疾病的发生。HDACs共分为三大类：Ⅰ类包括HDAC1、2、3、8、11，仅存在于细胞核内，在哺乳动物的组织中广泛表达，在调节细胞增殖和炎症反应中发挥重要作用；Ⅱ类包括HDAC4、5、6、7、9、10，存在于细胞质和细胞核，表达具有组织特异性；Ⅲ类包括Sirt1-7非锌指结构，活性依赖NAD。早期的研究显示吸烟可以上调HAT的表达，并降低HDAC的活性，致使肺巨噬细胞组蛋白H3乙酰化［15］。
研究显示吸烟者全身炎症反应增强可能与组蛋白乙酰化/去乙酰化失衡有关。HAT催化组蛋白乙酰化可以激活炎症基因的表达，促进炎症反应，而HDAC活性增加则可抑制炎症基因的表达。吸烟可以引起肺巨噬细胞的组蛋白H3乙酰化，增加促炎因子NF-κB和AP-1的表达，最终导致炎症反应增强［16］。在这一过程中，HAT和HDAC活性变化起到关键作用。多项研究显示吸烟可以上调并活化HAT，同时下调HDAC的表达，两者呈现相反的变化，导致组蛋白乙酰化增强，且炎症反应的强度与HDAC下降程度有关［17］。氧化应激亦能调控组蛋白乙酰化。经H2O2预处理的肺上皮细胞，其HAT活性、NF-κB和AP-1与DNA结合能力以及致炎细胞因子的表达均有所增加［18］。活性氧能够通过抑制HDAC，上调IL-8、IL-6、TNF-α和IL-1等促炎因子的表达，进而增加吸烟者的气道炎症［19］。HDAC表达下降除可引起气道炎症反应外，亦可促进细胞凋亡。研究发现，HDAC抑制剂能够诱导A549细胞凋亡［20］。Ahn等亦发现沉默HDAC7可抑制细胞有丝分裂的G2间期，促进细胞自噬和凋亡［21］。
2.吸烟与组蛋白甲基化
组蛋白甲基化修饰通常发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化。组蛋白H3的第4、9、27、36和第79位，H4的第20位赖氨酸，H3的第2、l7、26位及H4的第3位精氨酸都是甲基化的常见位点。H3的第4，36和79位赖氨酸甲基化与基因激活相关，而H3的第9、27和H4的第20位赖氨酸甲基化与基因沉默相关［22］。催化精氨酸甲基化的酶通常称为蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）家族，这类酶主要催化甲基从S腺苷甲硫氨酸向精氨酸中胍基氮的转移。而催化赖氨酸甲基化的酶通常称为含SET结构域的家族（suppressor of variegation-enhancer of zeste-trithorax domain）。有研究发现在吸烟所致的COPD肺组织内，PRMT4、5、6、9和10水平升高［23］。而COPD肺组织中PRMT2、4和6的表达变化则可能气道炎症相关［24］。体外研究显示，给予香烟烟雾提取物刺激的气道上皮细胞中组蛋白H4K20三甲基化减少，H3K27三甲基化增多［25］。H4K20三甲基化的减少与人类肿瘤的发生密切相关［26］。此外，氧化应激亦可上调人体血管内皮细胞中PRMT的表达［27］。我们的前期研究亦显示香烟烟雾提取物能够通过抑制PRMT6的表达，下调H3R2me2a，进而促进血管内皮细胞凋亡以及炎症反应。然而吸烟引起组蛋白甲基化的具体机制尚有待研究。
3.吸烟与组蛋白磷酸化
目前已知的组蛋白H3的磷酸化主要在其第10、28位丝氨酸（Ser10/Ser28）和第3、11位苏氨酸（Thr3/Thr11）上。组蛋白H3的Ser10和Ser28可接受两种方式的磷酸化修饰，一种是有丝分裂相关型磷酸化，有丝分裂期间组蛋白H3被广泛磷酸化，促进染色质的凝聚。在哺乳动物中，此型磷酸化主要由Aurora B激酶催化完成。另一种是胞外刺激造成的诱导型组蛋白H3磷酸化，与转录调控密切相关，仅出现在一少部分表达活化基因的核小体上，此型磷酸化主要由RSK（p90 ribosomal S6 kinases）和MSK（mitogen- and stress-activated protein kinase）介导。MSK是MAPK信号通路的重要下游激酶，其被ERK和p38激酶磷酸化激活，介导组蛋白H3及其他蛋白的磷酸化修饰。因此，MSK是MAPK信号通路的重要整合分子和执行分子，连接信号通路及表观遗传调控。组蛋白H3的Ser10磷酸化与前炎症因子NF-κB相关基因的激活密切相关。研究发现，吸烟能够通过激活MSK1诱导组蛋白磷酸化，进而促进促炎因子NF-κB以及TNF-a等的表达，促进炎症因子和趋化因子的转录及表达［28］。体外研究亦显示香烟烟雾提取能呈剂量依赖性的激活MSK1，并进一步介导组蛋白H3的Ser10和Ser28磷酸化，敲除MSK1则可显著降低气道上皮细胞中H3的磷酸化水平［28］。综上所述，组蛋白磷酸化参与吸烟诱导的炎症反应。
4.吸烟与组蛋白泛素化
组蛋白泛素化是将激活的含76个氨基酸的泛素蛋白的羧基末端与组蛋白亚基多肽链N端处的赖氨酸残基相互结合的过程，泛素-蛋白酶系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）在这个过程中发挥至关重要的作用。UPS主要作用于细胞内一些半衰期短的调节蛋白和一些结构异常、错构或受伤的蛋白。其主要过程包括：①游离的泛素在ATP参与下被泛素激活酶（E1）激活；②活化的泛素蛋白被转移到泛素结合酶（E2）的活性半胱氨酸残基上，形成高能硫酯键；③E2再将泛素传递给相应的泛素连接酶（E3）将泛素转移到靶蛋白上；④蛋白酶体识别多聚泛素化的靶蛋白并将其降解。在该途径中E3决定泛素-蛋白酶体系统降解靶蛋白的特异性［29］。泛素化过程通常仅有一种E1，多种E2和许多特异性的E3，其中每种E3都能特异性的催化泛素蛋白连接。目前报道的组蛋白泛素化修饰以H2A、H2B较多见。H2B单泛素化与基因转录激活有关，而H2A泛素化与转录抑制有关。Ottenheijm等［30］研究发现COPD患者中泛素-蛋白酶途径激活引起膈肌蛋白降解增加，导致膈肌收缩功能障碍。Debigare等［31］发现COPD患者骨骼肌和呼吸肌组织中泛素蛋白表达增加、多种泛素连接酶和蛋白酶体表达和活性增加，而且这些改变均与吸烟有关。Kim等［32］证实吸烟可通过泛素-蛋白酶系统诱导Akt蛋白降解。以上研究提示，吸烟导致的泛素-蛋白酶体系统异常活化在吸烟相关性疾病的发病中起重要作用。
三、吸烟与miRNA
哺乳动物的基因组中，仅约2%的RNA可被翻译成功能性蛋白，其余的不能编码蛋白质的RNA被称为非编码RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，其主要功能是表观修饰和基因调控。非编码RNA包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA（miRNA）等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA，其中研究最为广泛的是miRNAs。迄今为止，已经发现的人类miRNA超过2000种，人体约1/3的信使RNA受miRNA的调节。miRNA的基本功能是降解信使RNA或抑制其蛋白转录，在转录后水平抑制基因的表达，这提示miRNA表达变化将会导致某些功能蛋白表达异常，参与疾病的发生发展。作为不稳定的单链RNA，miRNA易受外界环境的影响发生突变，研究发现香烟烟雾暴露会使miRNA表达谱发生改变，绝大部分miRNA表达下调，且与吸烟的程度密切相关［33］。动物模型研究发现对大鼠和小鼠进行香烟烟雾连续暴露后，多种miRNA家族表达发生了变化，主要以表达下调为主。这些差异表达miRNA主要调控了细胞的应激反应、生长、凋亡、血管生成等效应［34］。Izzotti等人发现香烟烟雾暴露4周后，大鼠肺组织中126种miRNA表达下降，这种短期持续烟雾暴露所致的miRNA表达改变具有可逆性，停止烟雾暴露1周后miRNA的表达即可恢复；相反，若持续烟雾暴露4个月，miRNA的表达下降在停止暴露3个月后仍不能恢复，提示长期持续烟雾暴露可导致miRNA表达发生不可逆的改变［35］。与动物研究结果相似，人群研究也证实香烟烟雾暴露可以抑制miRNA的表达。从吸烟和非吸烟两组各10名志愿者的支气管上皮细胞中提取RNA进行miRNA芯片的检测发现，共有28个miRNA发生了表达变化，其中23个miRNA表达下调，仅有5个miRNA表达上调［36］。吸烟所致的miRNA表达受抑能上调基因和蛋白的表达，这一过程既能调节机体的适应性反应，保护机体抵抗吸烟所致的损害，又能调控应激反应、DNA修复、免疫反应、细胞增殖、凋亡、炎症反应等，参与疾病的发病机制。
四、总结
表观遗传学被认为是新世纪的生命科学焦点，表观遗传学补充了“中心法则”忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。越来越多的证据表明在人类疾病的发生过程中，表观遗传改变起了十分重要的作用。所以结合表观遗传学理论，进一步研究吸烟等外环境改变所致相关疾病DNA甲基化、组蛋白修饰和染色体重塑等表观遗传学规律，将有助于我们了解基因-环境相互作用的疾病发生机制，进而指导疾病的诊断和治疗。
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