第八节 RNA干扰
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA诱导的同源mRNA特异性降解,使基因失去表达功能,产生基因沉默,是研究基因功能的有效手段。
一、RNAi干扰的机制
如图2-1-7所示,细胞内双链RNA(dsRNA)在Dicer酶的作用下,形成21～23bp的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA为短小双链RNA,与体内一些酶(包括DNA内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。在RNA解旋酶作用下siRNA解链成正义链和反义链,然后卸下正义链,活化RISC。活化的RISC与结构基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,被切割后的mRNA随即降解,从而抑制该基因在细胞内的表达。
二、双链RNA载体的构建
RNAi研究中,双链RNA载体的设计和制备是关键之一。先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转到细胞内合成双链RNA。构建双链RNA表达载体有多种方法:
1.RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成。RNA多聚酶Ⅲ识别U6启动子,设计和合成一个21个核苷酸的片断(片断1),插入Bluescript载体中,再设计和合成与片断1反向的重复序列,并在其下游连接5个胸腺嘧啶,称为片断2。将片断2接到Bluescript载体中片断1的下游。将载体转移到细胞内后,转录出的RNA具有回文序列,会形成一个发夹样结构,从而得到了双链RNA。
图2-1-7 RNAi作用机制示意
2.RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA启动子。在H1-RNA启动子后面接上能形成发夹样结构的反向互补序列,将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA。
3.利用T7作为启动子合成dsRNA,将PCR产物用NotI酶切后自身连接,回收正向片断和反向片断,连接形成具有反向重复序列的片断,与pGEMTeasy载体重组,形成能表达ds RNA的载体(图2-1-8)。
用腺病毒做载体,在体内或体外表达dsRNA,均能成功地阻断基因表达。
图2-1-8 表达dsRNA载体的构建
三、RNA干扰的特征
1.RNA干扰是转录后水平的基因沉默。
2.高特异性 RISC复合物只降解与siRNA有同源序列的mRNA。
3.高效性 微量dsRNA就能抑制基因沉默,因为干扰过程中产生的siRNA可以作为引物,以目的mRNA为模板,在RNA聚合酶催化下形成的ds RNA,由此放大RNA干扰效应。
4.长距离效应 对RNAi敏感的细胞可通过表面跨膜蛋白质传递RNAi信号,使RNA干扰从起始细胞传递至其他敏感细胞,乃至全身。
5.表现遗传特性 RNA干扰不是细胞基因组DNA序列引起的,而是ds RNA诱导的可以遗传的基因沉默。
四、微小RNA
微小RNA(microRNAs,miRNAs)为长度19～25nt的内源性短链非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNA),具有高度保守性、基因表达时序性和组织特异性。miRNA 5'端的第2至第8位7个核苷酸称miRNA的种子区(seed region),是识别靶mRNA的关键序列,可与靶mRNA分子部分互补结合。一种miRNA能参与多个基因的表达调节,同一基因的表达可同时受多种miRNA调节,同一个家族miRNA可作用于许多相同的靶mRNA分子,是miRNA调控基因表达时的相对特异性。miRNA的命名采用miR+数字序号+字母序号,如miR-122、miR-27a等。种子区的序列相同而其他部分序列不同的miRNA归为一个miRNA家族,家族成员以字母序号表示,如miR-27家族包括miR-27a、miR-7b。
(一)微小RNA的来源及产生
人类细胞内大部分miRNA通过独立基因的转录及加工而产生,这是经典途径(canonical pathway)(图2-1-9);miRNA也可从其他基因产生,在相应的RNA转录后,经过一定的加工后产生miRNA。
图2-1-9 经典途径产生miRNA
(资源1) 经典途径产生miRNA(彩图)
在经典途径中,miRNA自身的独立基因在RNA聚合酶Ⅱ催化下,转录产生初级前体(primary precursor,primiRNA)。经转录后加工,在5'端加上帽子结构,3'端加上Poly(A)尾。在核内,pri-miRNA由Drosha进行第一步加工:Drosha与双链RNA结合蛋白DGCR8(DiGeorge syndrome critical region 8 homolog)形成Drosha-DGCR8复合物,加工形成具有发卡结构约70nt的前体,称为premiRNA。pre-miRNA通过输出蛋白(exportin 5)转运到胞质中。在胞质中,Dicer与双链RNA结合蛋白TRBP(TAR RNA binding protein)结合形成复合物,在TRBP的协助下,Dicer将pre-miRNA裂解,切除双链末端的环形结构,产生约20bp的miRNA/miRNA*双链分子。在加工之后,所产生的短双链RNA分子可与AGO蛋白结合参与组成miRNA诱导的沉默复合物(miRNA-induced silencing complex,miRISC)。双链RNA分子的一条链被释放并降解,称为过路者,常以miR*或miRNA*表示;而另一条链则保留在miRISC中,称为引导链,常以miR或miRNA表示。
除了由特定的基因编码产生miRNA之外,pre-miRNA的序列也可存在于蛋白编码基因的内含子序列中,或者存在于其他非编码RNA中。在这两种情况下,转录产生的RNA都可以形成含有pre-miRNA序列的茎环结构,Drosha-DGCR8复合物可从茎环结构的底部将RNA切断,释放出约70nt长的pre-miRNA。
(二)微小RNA的功能
miRNA的主要功能是通过与蛋白质结合形成miRISC,抑制靶mRNA的翻译或特异性切割靶mRNA,从而实现对靶mRNA的调节(图2-1-10)。该过程包括miRNA引导miRISC结合靶mRNA及miRISC抑制mRNA翻译两个步骤。miRISC主要与靶mRNA的3'-UTR结合,高效靶向mRNA需要miRNA种子区的7个核苷酸与mRNA的靶序列完全互补。miRISC还可直接抑制mRNA的翻译,也可通过P小体(processing bodies,P-bodies)阻止翻译。miRISC可抑制翻译起始因子eIF-4E的活性,从而抑制翻译的起始;miRISC也可与核糖体相互作用,使肽链合成反应停止。miRISC结合靶mRNA后,也可聚集于胞质中的P小体,mRNA的翻译被完全抑制。GW182蛋白是介导miRISC和mRNA参与组成P小体的关键蛋白。
图2-1-10 miRNA的功能
(资源2) miRNA的功能(彩图)
(三)微小RNA与疾病
miRNA的作用涉及个体发育、组织分化、细胞增殖和凋亡、病毒感染、癌症的发生发展等。miRNA在维持代谢稳态相关基因或蛋白的表达、胰岛素信号、葡萄糖稳态、心血管代谢疾病中亦发挥重要作用。例如miR-33对维持胆固醇和脂质稳态和控制胆固醇的输出及脂肪酸的降解起重要作用,miR-122控制肝内胆固醇的合成及脂蛋白的分泌。此外,miR-106、miR-758、miR-26、miR-370、miR-378/378*、miR-27、miR-34a和 miR-335等参与调节脂代谢。
(四)循环miRNA与疾病的诊断
miRNA可以稳定地存在于血浆或血清等多种体液中,称为循环miRNA。循环miRNA来源于破裂的细胞被动渗漏或通过微囊泡主动分泌。在病理情况下,某些miRNA在血浆中富集。血液循环miRNA不仅可以作为疾病状态的生物标志,也会影响其他靶器官或细胞的基因表达。在前列腺癌患者血清和组织样本中均显示miR-375和miR-141高表达。心肌梗死时,血浆 miR-208、miR-1、miR-133a、miR-21增加。肝硬化及肝损伤时miR-122增加,2型糖尿病患者miR-126增加。
(五)微小RNA在疾病靶向治疗中的作用
抗微小RNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides,AMOs)属miRNA基因治疗的手段,是化学修饰的寡核苷酸类似物,可使小RNA分子穿过物理屏障,提高治疗效果。AMOs直接和特异性与miRNA结合,抑制miRNA与靶mRNA的结合。设计miRNA类似物,与内源性miRNA具有相同的核苷酸序列,能发挥相似作用和效果。miRNA还可通过病毒为载体引入细胞,发挥治疗作用。
五、长链非编码RNA
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)为大于200nt的调节性非编码RNA,lnc RNA序列保守性较低,有明显的时空表达特异性。不同lncRNA的长度差异非常大,较小的lncRNA在200nt左右;较大的可达到数千碱基对(kb)。通常将长度在100～200nt之间的调节性非编码RNA称为长链非编码RNA。lnc RNA根据来源、功能或者与某一基因相关而命名。lnc RNA缺乏编码蛋白质的能力,以RNA形式在多种层面调控基因表达。
(一)lncRNA的来源及产生
大部分lnc RNA由RNA聚合酶Ⅱ转录产生。多数lnc RNA转录后无加工,有少数在转录后有mRNA的加工过程,剪接形成较短的lnc RNA,以及加帽子和加尾。lncRNA可从DNA序列转录产生。根据其在基因组上相对于蛋白编码基因的位置,分为正义lnc RNA、反义lncRNA、双向lnc RNA、内含子lncRNA、基因间lncRNA 5种类型。这种位置关系可推测lncRNA的功能。
(二)lncRNA的功能
lncRNA位于细胞核或细胞质中。核内lnc RNA参与基因转录、加工及运输的调控。胞质中的lncRNA参与翻译过程及蛋白质靶向运输的调控。lncRNA分子较长,常形成许多特殊结构,或存在特殊的一致性序列,可与不同的分子相互作用而发挥功能。不同的lncRNA通过与mRNA、小分子RNA、RNA结合蛋白及DNA结合调控基因表达。lncRNA在多种层面调控基因表达,包括表观遗传学调控、转录调控、转录后调控三个层次。某些特异的lncRNA招募染色质重构和修饰复合体到特定位点,改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态,进而控制相关基因的表达。lncRNA也可作为配基,与转录因子结合形成复合体,控制转录活性。lncRNA还会直接参与mRNA转录后的调控过程,如剪切、RNA编辑、蛋白翻译及转运等。
(三)lncRNA与疾病
基因表达的每一个阶段几乎都有lncRNA参与调控,许多疾病的发生也与lncRNA的突变或失调有关,这种变化能够作为疾病诊断的标志物和潜在的药物靶点。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)与患者脑中β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)大量表达有关,Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经分泌酶剪切加工后形成的产物。β分泌酶1(BACE1)是剪切APP的分泌酶之一,BACE1的反义转录本lncRNA BACE1 AS是AD发生发展中的重要调节物质。lncRNA也是癌症及血管疾病基因转录的重要调节因子。在许多癌症的发生发展中均伴随着lncRNA异常表达,例如lncRNA H19促进膀胱癌的转移,ANRIL在前列腺癌中表达上调,HOTAIR与乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胃肠癌、胰腺癌的预后不良有关。KCNQ1OT1、HI-LNC45、HI-LNC78、HI-LNC80、HI-LNC25β、ANRIL与糖尿病的发生有关。
六、RNAi在医学研究中的应用
(一)高通量研究基因功能
在功能基因组研究中,比较RNA干扰前后表型变化,可以认识基因的功能。在一般实验室,只需一周时间就能使数十个基因关闭,工作效率很高。功能未知的基因的编码区或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达,在转基因个体内转录的RNA形成双链RNA,通过RNA干扰,使目的基因沉默,然后分析基因的功能。人类的全部基因组序列已测试完毕,通过RNA干扰技术已发现大量新基因及其功能。
RNAi技术能同时使多个基因或基因家族沉默,研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查。
(二)研究信号转导通路的新工具
RNAi能高效特异地阻断基因表达,是研究信号转导通路的新工具。胰岛素和受体结合后活化Dsor1(MEK的类似物),Dsor1活化后激活Eek A(ERK的类似物)。以Dsor1为靶标的双链RNA阻断Dsor1的表达,使Eek A不能活化,细胞对胰岛素刺激反应显著下降,表明Dsorl是胰岛素信号转导通路的重要环节(图2-1-11)。
图2-1-11 RNAi研究胰岛素介导的信号转导通路
(三)抗肿瘤细胞增殖和侵袭转移
肿瘤是多基因、多因素相互作用引起的疾病。传统治疗技术阻断单一癌基因不能完全抑制或逆转肿瘤的生长。RNAi可以利用同一基因家族的多个基因所具有的一段同源性很高的保守序列设计双链RNA(ds RNA),注射这种ds RNA可以产生多个基因沉默;同时注射多种dsRNA可使多个序列不相关的基因沉默。已有人应用RNAi技术阻断MCF7乳腺癌细胞中异常表达的、与细胞增殖分化相关的核转录因子Sp1基因的功能表达。此外,RNAi识别精确到一个核苷酸,对由点突变形成的癌基因(如ras,p53等),能准确有效地靶向封闭癌基因表达,而未伤及正常细胞。
针对慢性粒细胞白血病的融合基因设计的miRNA,能够明显地促进白血病细胞凋亡。利用人工合成的siRNA、miRNA或用DNA表达载体表达特异dsRNA,均能靶向封闭与肿瘤转移相关的基因。如Bcl-2、EGFR和VEGF等基因的ds RNA能使这些基因沉默,有效地抑制肿瘤的生长。黑色素瘤带有N-ras或BRAF激活性突变,用RNAi技术使这些突变基因沉默,抑制肿瘤生长和侵袭转移能力。
利用生物芯片分析各种肿瘤组织miRNA的特异性和实效性,对肿瘤诊断和预后分析能起重要作用。如肺腺癌与正常肺组织相比有17种miRNA表达发生变化,肺鳞癌有16种发生变化。miRNA let-7和miR-17-92可作为非小细胞肺癌和小细胞肺癌的诊断指标。同时与肺癌密切相关的miRNA let-7、miR-155、miR-17-92和 miR-21将成为肺癌基因治疗的靶点。与肺癌预后有关的至少有8种miRNA。
(四)RNA干扰对肌萎缩侧索硬化症动物模型神经变性的作用
过度表达突变型超氧化物歧化酶(SOD1)导致人类进行性麻痹型肌萎缩症。使用RNA干扰技术抑制SOD1基因表达,能延迟这类肌萎缩症的发作和进展(图2-1-12)。
图2-1-12 RNA干扰技术阻止肌萎缩侧索硬化症动物模型的神经变性
(五)RNA干扰与新药研制
复制dsRNA能有效降解双链RNA病毒的基因组,杀灭双链RNA病毒。RNAi技术也可抑制HIV、HBV等DNA病毒。如HBV基因的dsRNA、siRNA或miRNA组建的载体引入细胞或活体,均可抑制DNA病毒复制,但必须选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列,以便避免对正常组织细胞的毒副作用。
利用RNAi作用的靶位基因,可设计开发创新性药物。例如miR-122调节肝内胆固醇和脂类代谢,关闭这种miRNA能显著降低血浆胆固醇。miR-122在丙型肝炎病理变化中也起重要作用,miRNA干扰疗法治疗丙型肝炎正在进行临床试验。利用RNA干扰血管内皮生长因子(VEGF)或其受体基因的表达,治疗黄斑变性的新药已经问世。
随着RNAi机制研究的深入和RNAi技术的日趋完善,人工构建或合成的dsRNA、siRNA均能使相应的基因发生转录后沉默。小分子化合物还能增强siRNA或miRNA的干扰作用。RNAi对基础和临床医学研究有令人鼓舞的前景。但是RNA干扰技术作为临床治疗药物仍有局限性,如半衰期短、生物利用度低和细胞毒性以及miRNA的免疫反应等问题。