第四节　DNA序列分析

DNA序列分析即DNA分子的核苷酸顺序测定。

Sanger酶学方法测定DNA分子中核苷酸序列的基本原理是利用DNA聚合酶进行多核苷酸的酶促合成。在反应混合液中有模板、引物、酶、四种d NTP(其中之一为标记的d NTP),以及与四种正常的d NTP成一定比例的dd NTP(2',3'-双脱氧核糖核苷三磷酸)。例如dd ATP,在多核苷酸合成过程中遇到d ATP掺入的位置就有两种可能的情况发生,如果是d ATP掺入,则链继续延长,如果是dd ATP掺入,合成反应就停止,链不再延长。因为dd ATP脱氧戊糖的3'位置C没有连接羟基,不能参加3',5'磷酸二酯键的合成,这样就得到一系列长度不同的、以ddA结尾的一组片段。同理,也可以得到以ddG、dd C、dd T结尾的片段。在变性条件下,对这些片段进行能分辨一个单核苷酸长度的凝胶电泳和显影,可以直接读出DNA片段的碱基顺序(图2-1-4)。目前运用荧光标记和机器人测定核苷酸顺序,工作效率非常惊人。

图2-1-4　用Sanger酶学方法测定DNA中核苷酸顺序