按照临床治疗为目的研发的人脐带间充质干细胞注射液，除了严格按照制备工艺技术生产之外，最终产品还需经过国家认定并有细胞产品评价经验的新药评价机构利用标准化实验动物进行急、慢性毒性和致瘤性试验来验证和评价其安全性。

过敏反应检查法是将一定量的hUCMSC注射液供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定hUCMSC注射液是否引起动物全身过敏反应。

取健康合格豚鼠6只，体重250~350g，雌鼠应无孕。在试验前和试验过程中，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的豚鼠不得重复使用。隔日每只每次腹腔或适宜的途径注射供试品溶液0.5ml，共3次，进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征，首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重。然后将其均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射干细胞溶液lml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状。

静脉注射干细胞溶液30分钟内，不得出现过敏反应。如在同一只动物上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一者，判定hUCMSC注射液不符合规定。

本法系将一定量hUCMSC注射液与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。

取健康家兔血液，置于含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入约10倍体积0.9%氯化钠溶液混匀，1000~1500r/min，离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2~3次，至上清液清亮无色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液制成2%的混悬液备用。

充分混匀干细胞混悬液，取一定体积混悬液备用。

取洁净5只玻璃试管编号，1、2号管为干细胞供试品管，3号管为阴性对照管，4号管为阳性对照管，5号管为供试品对照管。按下表所示依次加人2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、纯化水，混匀后立即置于（37±0.5）℃的恒温箱中进行温育3小时后观察溶血和凝聚反应，加入顺序和量如表7-2所示。

（1） 如试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，但1、2号管和5号管肉眼观察无明显差异，则表明无溶血发生。

（2） 若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，轻轻倒转3次仍不分散，表明可能有红细胞凝聚发生，应置显微镜下观察，如可见红细胞聚集为凝聚。

（3） 当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若2支干细胞注射剂管中的溶液在3小时内均不发生溶血和凝聚，判定hUCMSC注射液符合规定；若有1支干细胞注射剂管的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，应设4支干细胞注射剂管进行复试，其hUCMSC注射液管的溶液在3小时内均不得发生溶血和（或）凝聚，否则判定hUCMSC注射液不符合规定。

Wang等在对间充质干细胞的安全性进行评价时，通过给食蟹猴反复输注间充质干细胞的给药方式和长期毒性进行了评价，食蟹猴接受4次间充质干细胞注射后对其病理组织切片等进行检测，均未发现注射了间充质干细胞对食蟹猴的各项生理指标产生不良影响。利用本实验室创制的“hUCMSC注射液”，分别以1×10 ⁶细胞/kg、5×10 ⁶细胞/kg和1×10 ⁷细胞/kg的剂量通过静脉输入健康食蟹猴体内，结果对心、肝、肺、肾、脑等重要器官的结构无影响。

按照实验方法的不同可将致瘤实验分为体外致瘤试验和体内致瘤试验两种，为保证实验的准确性，hUCMSC注射液的致瘤性分析一般需要体内、体外实验同时进行，相互验证。

体外致瘤性是指将待检细胞接种到软琼脂上进行长期培养，连续3周观察接种的细胞是否能在软琼脂上形成桑葚状的克隆团，以此来间接证实该细胞是否具有肿瘤细胞致瘤的特性。

取状态良好的对数生长期的Hela细胞，消化后用含胎牛血清的RPMI1640/MEM完全培养液制备成一定浓度的细胞悬液备用。

制作方法同上，只是细胞换成MRC-5细胞。

用含胎牛血清的DMEM/F12完全培养基调整hUCMSC成一定浓度备用。

分为底层琼脂制备和上层琼脂制备。先用蒸馏水分别配制两个不同浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，置于40℃温水中而保持不凝固，然后等体积将高浓度琼脂糖和含2倍胎牛血清的DMEM/F12培养基混匀，取2ml混匀的琼脂培养液加入6孔板的每孔中，不能有气泡，室温静置凝固备用。分别将低浓度琼脂培养液与制备好备用的细胞等体积混匀，均匀地铺在有底层琼脂的6孔板中，1ml/孔，静置后镜下观察细胞分布是否均匀。将培养板置37℃ 5%CO ₂培养箱中培养。每周1次镜下观察是否有克隆形成，并且拍照记录，连续观察3周至阳性对照生长出明显克隆为准。

一般肿瘤细胞经过1~3周的培养在上层琼脂内可见桑葚状克隆团形成，镜下观察可见克隆内的细胞呈透亮的圆形团状。一般认为由16个细胞以上组成的细胞团为一个克隆，克隆团内的细胞数目随着培养时间延长而增多。如果见细胞成颗粒状且轮廓不清楚，说明细胞已死亡。如连续3周仍未见克隆团形成，则考虑接种的细胞没有肿瘤特征，间接反应该细胞的移植后无致瘤性。

致瘤性是指将待检细胞接种动物后，诱导动物本身细胞形成肿瘤的特性。对于异体来源的干细胞制剂或经体外复杂操作的自体干细胞制剂应该检验细胞的致瘤性。

可采用新生（出生3日龄内）裸鼠或新生仓鼠及新生大鼠，分成3个组进行致瘤性检查。

hUCMSC。

将细胞消化后吹打分散成单细胞悬液，充池计数细胞，然后用生理盐水重悬细胞为一定浓度备用。也可根据具体情况而定，可采用PBS作为阴性对照。设置阴性对照可监测接种动物的自发肿瘤发生频率。

方法同上。

采取在裸鼠右前肢腋窝皮下缓慢单次接种0.2ml/只。

（1） 每周观察并触摸接种部位是否有结节形成，应至少观察4个月。

（2） 观察期内如有1个或多个结节出现，则应每周双向测量结节大小并记录结果，以确定结节是进行性生长、保持稳定不随时间而消退。有进行性结节生长的动物，当结节达到直径约2cm或国家规定的大小时应处死。

（3） 观察期末，处死所有动物，肉眼及显微观察接种部位或其他部位是否有瘤形成。任何疑似瘤均应采用4%浓度甲醛溶液固定后进行组织学检查。

（4） 显微检查肝、心、肺、脾及局部淋巴结是否存在转移性损伤。如有肿瘤形成，则要分析与接种部位原发瘤的相关性，如组织学检查显示与原发瘤不同，则要考虑可能有自发瘤形成，这种情况需跟踪结果。

（1） 观察期末，如接种部位或其他远端部位未观察到进行性生长肿瘤，即可判定细胞无致瘤性。

（2） 在致瘤性检查中形成的所有肿瘤均应检查其基因组DNA，分析是否有接种细胞来源的DNA。

（3） 对致瘤性检查中出现进行性结节的细胞基质，应考虑开展进一步的研究，鉴别致瘤性因子或致瘤性活性，并确定细胞的可适用性。

目前普遍认为，hUCMSC用于临床的安全性较高，而对恶性肿瘤生长起抑制还是促进作用尚存在争议，既有许多抑制肿瘤细胞生长的证据，也有一些报道认为hUCMSC可促进肿瘤生长，因此提醒临床对恶性肿瘤患者使用hUCMSC注射液应慎重，最好不要给肿瘤患者输入hUCMSC注射液，对于恶性肿瘤已经治愈的患者是否可使用hUCMSC治疗，目前尚没有肯定的答复，通常建议恶性肿瘤治愈患者5年内慎用hUCMSC治疗。hUCMSC的促瘤性分析一般是采用肿瘤模型进行，即将特定的恶性肿瘤细胞接种于免疫缺陷鼠（SCID小鼠或裸鼠）皮下，同时或待肿瘤形成之后，给肿瘤模型鼠输入一定数量的hUCMSC，观察输入和未输入hUCMSC鼠的肿瘤生长速度、比较肿瘤大小和重量等，根据结果判定hUCMSC的促瘤性。

hUCMSC注射液的慢性毒性试验一般应采用大动物，最好是灵长类动物进行评价。通常是给健康动物连续多次输入临床治疗剂量及高于临床治疗剂量5~10倍的hUCMSC注射液，系统观察动物的反应及重要器官的功能和组织学变化。国内外关于hUCMSC慢性毒性实验报道较少，本实验室报道了利用自制的“hUCMSC注射液”和食蟹猴的UCMSC细胞悬液，分别以1×10 ⁶细胞/kg、5×10 ⁶细胞/kg和1×10 ⁷细胞/kg的剂量通过静脉输入健康食蟹猴体内，每2周1次，连续8次，系统性观察了心、肝、肺、肾、脑、皮肤、肌肉等重要组织器官的结构及血液细胞学、免疫细胞亚群、血液生化指标、微量元素等的变化。结果证实，hUCMSC注射液对健康食蟹猴的组织器官的结果无影响，免疫细胞亚群的比例有一定下降，但停用hUCMSC注射液2周后恢复正常。在最后一次输入hUCMSC注射液后，连续3个月动态观察食蟹候的临床表现，检测血液细胞学和生化指标，最后取材追踪hUCMSC在体内的残留、分部和变化情况，结果发现hUCMSC注射液对观测指标无显著性影响，表明hUCMSC注射液无慢性毒性作用，也未检测到hUCMSC在体内长期残留和分布。值得注意的是，国内外报道的结果大多数是将人的间充质干细胞输入动物体内后观察其慢性毒性，我们的实验设计是用人源hUCMSC和食蟹猴的UCMSC平行输入食蟹猴体内，结果对临床更具有参照性。该实验至少说明三个问题：一是同种异体和异种脐带间充质干细胞输入体内均不产生急性免疫排斥反应，也不产生慢性毒性作用；二是反复多次大剂量输入的hUCMSC并不长期在健康食蟹猴体内残留、分布；三是至少在1×10 ⁶~1×10 ⁷细胞/kg的剂量范围内，hUCMSC治疗食蟹猴的安全性较高。