为了保证UCMSC的质量，必须建立稳定可靠的UCMSC分离扩增标准操作规程外，很重要的一点就是要确保包括环境设施条件及脐带采集、UCMSC分离扩增等流程在内的一系列质量控制与管理制度有效发挥监管作用。

1.脐带采集必须坚持无菌操作，努力排除携带病原微生物的脐带用于UCMSC的分离培养，如果采集人脐带用于制备临床应用级别的UCMSC，必须严格执行脐带采集健康体检制度，严防使用携带病原微生物和患显性遗传病的脐带，特别注意排除潜伏期感染病原微生物的可能，在UCMSC制备的整个过程中必须始终贯穿无菌环境和无菌操作的理念，避免所有技术操作环节中一切导致污染的可能。严格执行脐带保存和运输管理制度，避免保存和运输条件改变导致细胞活性改变，专人负责转运，避免人为交接错误。

2.如果采集人脐带，必须符合伦理和法规，在采集之前需征得产妇同意并签署知情同意书，还应按要求向遗传资源采集与保存管理部门申报并获得遗传资源采集资质。

要确保脐带间充质干细胞制剂的质量达标，必须从源头上严格执行质控标准，首先必须严格从事细胞制备技术人员的入选标准和技术操作要求。从事临床级hUCMSC的技术人员应具有医学、生物学、生理学、医学检验、生物化学、细胞生物学、遗传学等相关知识背景，一般应接受过医学相关专业的系统性本科学历教育或长期从事细胞制备技术工作，具有一定细胞生物学技术相关实践经验的技术人员。从事UCMSC制备工作前，应接受胚胎发育生物学、胎盘解剖结构、妇幼保健、产科学、临床生物制剂、干细胞理论、干细胞制剂及研究技术规范、相关法规、脐带采集、脐带间充质干细胞分离培养及鉴定、质量控制、诱导分化、储存、复苏、运输等专门知识和技能培训，熟练掌握专业理论、操作技能，了解细胞制备实验室运行管理及操作流程、规范等，并经考核合格后，方可从事UCMSC制备工作。对从事UCMSC制备工作的相关要求如下：

1.从事UCMSC的技术人员必须进行健康体检，排除携带细菌、病毒、支原体、衣原体等病原微生物及传染性疾病，避免操作过程中污染细胞的可能，长期从事该工作的技术人员应每半年进行1次健康体检，传染性疾病患者不得参与UCMSC制备操作。

2.进入细胞制备实验室的人员必须学习和了解实验室管理要求，遵守实验室操作流程和规范，服从实验室管理人员的监督管理。

3.为避免差错事故，UCMSC制备过程中应由3名细胞生物学专业或受过专业培训的技术人员密切配合，在检验合格的细胞工程实验室完成实施，其中两名技术人员主要负责超净工作台上的细胞处理操作，另外1名技术人员主要负责流程监督及操作人员的技术操作行为，以防操作过程中的技术差错和样本标签书写错误等，协助离心机操作、传递所需物品及信息。

4.应合理控制进入实验室的人员数量，进入细胞制备实验室的操作技术人员必须注意个人卫生，避免长头发、长指甲等暴露而导致细胞污染，严格按照规定穿戴好无菌隔离服和手套，严禁带入与工作无关的任何生活用品（如手机、各种首饰等），严禁谈论与当时工作无关的话题。

5.按照人流、物流分开的原则，严格实行物流通道和人员进入通道分开的管理制度，装有脐带组织的容器必须经酒精彻底消毒处理后方可进入UCMSC制备实验室，所有进入实验室的物品必须在传递窗去包装并消毒处理后转入操作室，严禁不合格的器材和培养试剂进入实验室而造成污染。

6.标准化的设施和设备条件是保证UCMSC制备及保证质量的基础，应建立符合GMP标准的UCMSC生产的规范化实验室并配制必需的细胞制备与质量控制基本设备。建立科学、合理、规范的技术流程和技术操作规程并严格执行是获得标准化UCMSC产品和保证质量的关键，在UCMSC制备过程中应建立技术层面的总流程和分流程，针对每一个关键技术环节建立相应的技术操作规程，实施过程中应进行动态监督、管理。

7.实验室及100级超净工作台必须保持洁净，不能摆放无关物品（图6-12A），且在使用前必须紫外线照射消毒30分钟以上。培养液等配制和细胞分离等开放性操作只能在100级超净工作台上的酒精灯前无菌区（图6-12B）进行，而且要尽量缩短暴露细胞于密封容器外的时间。

8.原代培养的关键环节是组织块制备、贴壁处理和培养体系，组织块制备过程应简单、快速、尽量剪碎成1mm ³以下，以便脐UCMSC从组织中延伸生长。组织块贴壁是脐带间充质干细胞贴壁生长的先决条件，组织块贴壁培养过程应避免培养液过多而导致组织块飘浮而不能贴壁，可在组织块接种时只加入少量培养基或直接将糊状组织直接接种于培养瓶底，待贴壁牢固后在补加培养液。脐带间充质干细胞培养物理环境：渗透压：280~330mOsm/kg H ₂O，温度：37℃，酸碱度pH 7.0~7.2。细胞制备操作动作要坚持简、快、准的基本原则，严格执行脐带间充质干细胞分离培养操作程序，避免延时操作而影响细胞活性。

9.必须使用洁净无菌的玻璃吸管等器材，一般常用一次性试管、吸管、容器等，严禁在实验室反复使用，严防交叉污染。培养瓶的特质也是组织块贴壁的关键因素，应尽量采用改性处理的塑料培养瓶，因为这类塑料培养瓶具有亲水性，UCMSC具有在塑料瓶壁黏附生长的特性，而且一次性使用成本较低。

10.严禁在敞开的容器上方操作，装有试剂或细胞的容器应避免开盖状态下直立放置，开盖的容器必须倾斜45°角取用或放置。

11.制备用于动物实验的细胞必须高度重视致热原污染，必须确保使用的材料合格有效（如材料无菌、无热原，培养液无菌并在有效期内等）。与干细胞直接接触的物料，应选择国家批准的临床应用产品，并建立抽样检验制度，达到所规定的质量标准之后由质量管理部放行以供使用。如无国家批准的临床应用产品，应符合国家相关管理要求。制备临床应用级别的UCMSC要求更高。

12.UCMSC的培养体系通常以DMEM/F12培养基为基础添加血清、生长因子等，市场上销售的DMEM/F12培养基有粉剂和液体类2种，建议采用生物公司配制好的液体培养基，但不同来源的培养基质量可能有差距，最好固定来源。在培养基中添加血清是惯用做法，但应高度重视来源和排除病原生物，特别是病毒类病原，涉及临床使用的细胞最好不用胎牛血清，可用人源血清或血小板生长因子替代，在培养体系中添加bFGF、FGF、SCF等生长因子，可促进脐带间充质干细胞生长和维持其干细胞特性。使用无血清培养基是未来脐带间充质干细胞体外制备的发展趋势，其特点是排除了使用血清可能带来的风险，但目前存在的问题是成本较高，不利于大规模使用。严禁使用可能导致细胞遗传特性改变成分的条件培养基，严禁使用来自海绵体状脑病疫区的牛血清，应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性材料，不应使用抗生素，确保干细胞制剂中残留的培养基成分对患者应无不良影响。

13.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题，也是影响细胞质量的深层次问题。在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后，个别细胞会发生染色体变异。

14.应在脐带间充质干细胞制备的不同阶段严格执行操作规程及质量控制标准，确保制备的脐带间充质干细胞制剂无病原微生物污染，无内外源毒素污染，确保细胞活力、细胞纯度、均一性、细胞染色体等细胞结构及其生物学特性高度稳定，达到临床应用的质量标准。

15.为保证临床治疗的安全性和有效性，UCMSC制备及鉴定操作人员必须如实认真填写细胞制备、鉴定及质量控制信息并签字确认，技术监督人员应对技术操作和细胞质量鉴定签字负责，确保只有鉴定合格的脐带间充质干细胞才能被冻存入库保存备用。

1.体外培养的脐带间充质干细胞对EDTA-0.25%胰酶消化比较敏感，胰蛋白酶的最佳活性温度是37℃，消化时间3~5分钟，消化过程中应注意控制消化酶作用的时间和温度，消化3分钟后应密切观察细胞形态和脱落状况，避免消化过头而导致细胞活性降低。一旦发现细胞收缩成圆形和晃动培养瓶有大量片状细胞脱落时，应立即加入含20%血清的培养基终止消化，如果还有部分细胞贴壁，可采用吹打和敲击瓶底的办法使细胞脱落。如果还有部分细胞难以脱落的话，可先吸出脱落细胞后再加少量消化液继续消化或直接加入培养基继续培养。

2.冻存细胞的离心洗涤过程也是影响细胞活性的重要因素，应尽量减少机械性损伤的可能因素，离心转速和时间应针对不同实验条件和不同的离心机摸索确定，以达到沉淀细胞为准，不宜转速过高和离心时间过长，本实验室采用的离心参数是400g离心10分钟，洗涤次数不超过3次，一般2次即可。

3.冻存液对脐带间充质干细胞的活性有一定影响，关键环节是冻存液的成分和质量、冻存降温和复苏过程及操作过程中对细胞的损害。脐带间充质干细胞保存液通常是在DMEM/F12完全培养基的基础上添加5%~10%的DMSO、2%白蛋白，加入SCF、bFGF EGF等细胞因子有利于维持细胞活性，冻存管的细胞悬液不宜装入过多，以免冻、融过程中膨胀后裂损而导致污染。

4.操作过程中应特别注意注明和核对标签，确保冻存细胞的编号或标识前后一致。

5.入库或提供临床使用的脐带间充质干细胞制剂必须无菌分装，分装容器必须无毒性、无污染，标明名称、体积、数量、活性、批号、制备人等，同时留样长期储存被查，所有技术资料应完整和可溯源。

6.有条件的细胞制备实验室，应建立细胞制备过程物联网管理信息系统，实行全过程监督管理和信息资料可视化，尽可能避免差错、遗漏。

7.复苏时应从液氮中取出装有细胞的冻存管后，立即置于40℃温水中并注意晃荡使其快速融化，融化过程中应保持适当距离，防止冻存管爆炸伤害眼睛等。融化后应用酒精棉球擦拭干净冻存管，避免开盖时外源水或杂质进入。融化后应立即进入洗涤程序，尽量减少干扰因素。

8.细胞接种密度影响传代扩增的培养实践，采用1∶3的比例，即相同面积的培养瓶以1瓶细胞传为3瓶较为合适。静置培养过程中应尽量不要晃动培养瓶，每次观察细胞应小心轻放，注意观察培养液的颜色变化和pH值改变，发现培养液变黄应及时换液，一般3天左右换1次。

UCMSC在疾病治疗中的主要特点是：①必须保持其生物活性才能有效发挥作用，一旦活性丧失，疗效也就随之减弱或丧失，坏死细胞或分解产物可能还会导致副效应，因此，必须保证用活细胞治疗；②UCMSC参与损伤修复功能取决于其到达组织的微环境条件，UCMSC的分化方向具有组织微环境依赖性，如果损伤组织的微环境发生了质的变化，UCMSC到达损伤组织后也未必会按预期目标分化；③UCMSC的疗效机制比传统药物复杂，有其本身的直接参与，也有其分泌多种细胞因子及外分泌体的调节作用；④不论针对什么疾病实施UCMSC治疗，其固有的免疫与炎症调节作用依然存在，而且具有双向调节作用；⑤用于急性组织损伤性疾病治疗具有靶向归巢特性，不论通过何种途径进入体内，它都能自己寻找并迁移到最需要的地方去发挥治疗作用，但是对陈旧性损伤的促进损伤修复作用则可能主要依靠其分泌作用；⑥主要适用于涉及组织损伤、缺血、退变、炎症、坏死类疾病，对大多数此类疾病治疗有效，但量效关系及机制尚不十分明确。在实施UCMSC治疗疾病的具体实践中，选择不同的治疗途径和时机可能在疗效上有一定差异，因此应根据疾病性质和治疗目的，选择合适的治疗途径，原则是有利于UCMSC进入病变组织。一般来说，用于系统性损伤、自身免疫性疾病、老年退行性疾病、炎症性疾病等，可选择系统性血管输入途径，而对于一些局部组织损伤或诊断明确的陈旧性损伤，应尽量选择定位移植或靶向血管介入治疗途径，总体原则是有利于足够数量的细胞到达损伤组织并发挥作用。

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