脐带间充质干细胞通常按原代培养密度1∶3的比例进行传代培养。传代培养至第3代，即可获得相当数量的UCMSC。通过消化和传代培养细胞，可以淘汰非间充质干细胞，因此，传代培养的过程就是纯化间充质干细胞的过程。然而，长期在体外传代培养的UCMSC是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题，也是影响细胞质量的深层次问题。国外对骨髓间充质干细胞体外长期培养研究发现：如果在体外连续传代培养60次以后就会观察到间充质干细胞衰老和自动向脂肪细胞分化。笔者长期培养实验证明：在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后，个别细胞会发生染色体变异。因此，体外传代培养第3~5代获得的UCMSC不仅纯度高、活性好，更重要的是安全性高，细胞核型稳定性好。目前研究显示，体外培养的人骨髓间充质干细胞可发生自发转化，脂肪间充质干细胞传代培养后染色体发生改变，小鼠间充质干细胞经体外培养后，出现染色体畸变。这些研究表明，不同来源的间充质干细胞经体外培养后，遗传学特性可能会发生改变。同时也有研究显示，小鼠骨髓间充质干细胞体外培养至50代仍未发生染色体改变。因此，在脐带间充质培养的过程中，必须监测其核型的稳定性，尤其是如果按照临床应用级别制备的UCMSC注射液，则必须检验鉴定UCMSC的染色体，预防遗传突变威胁到临床使用的安全性。

脐带间充质干细胞在有丝分裂期，染色质变粗变短，形成染色体。特别就是有丝分裂的中期，染色体的长短、大小、着丝点等的特征最为典型，容易观察。因此，用秋水仙素破坏细胞纺锤丝阻抑细胞中期分裂，以获得大量的中期分裂象，经后期处理后，Giemsa染色，在油镜的观察下可看到清晰分散的染色体。通过对染色体数量形态的观察，来判定hUCMSC的核型是否正常。

（1） 秋水仙素溶液：同生理盐水配制100μg/ml的秋水仙素溶液，过滤除菌，-20℃保存备用。

（2） 0.075mmol/L KCL 溶液。

（3） 固定液：3份甲醇加一份冰醋酸，临用前配制。

（4） 1∶10 Giemsa染液。

（5） 其他：离心管、吸管、清洁处理的载玻片、离心机、恒温水浴锅、显微镜。

（1） 取传代后第3~4天处于增殖指数期的细胞（P3代），更换新鲜培养液。将秋水仙素加入培养液中（终浓度为0.04~0.08μg/ml），继续培养4~6小时。

（2） 吸去含秋水仙素的培养液，加入胰酶消化细胞，1000r/min离心10分钟。弃上清液。

（3） 低渗处理：逐滴加入0.5ml预温37℃的0.075mol/L KCl混匀，随即补加至5~10ml，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育20~30分钟。

（4） 预固定：向管中加入1ml新鲜固定液，1000r/min离心10分钟，弃上清。

（5） 固定：沿管壁缓缓加入新鲜固定液8~10ml，用吸管轻轻吹打均匀，固定15~20分钟。然后离心，吸净上清液。

（6） 再固定：缓缓加入新鲜固定液，固定30分钟。

（7） 离心，吸除上清液，视细胞量再加0.5~1.0ml新鲜固定液，吹打均匀。

（8） 制片：取0℃冰冻的载玻片，距载玻片15cm高度，向玻片滴1~2滴细胞悬液，于空气中干燥。

（9） 染色：用Giemsa染液染10~20分钟，流水冲洗，晾干。

（10） 封片：二甲苯透明3次，中性树胶封片。

（11） 镜检：在镜下选择染色体分散良好、不重叠、无散失的标本，于油镜下观察记录，分析核型，并进行拍照。

通过染色体核型分析，表明hUCMSC为正常二倍体细胞核型，为46 XY或46 XX（图6-10，图6-11）。如遇到有染色体数目异常或有插入和缺失突变的个体，应立即排除。培养时间过长的hUCMSC更需严密监测其核型。