第六章　脐带间充质干细胞的鉴定及质量控制与管理

脐带间充质干细胞（umbilical cord mesnchymal stem cell，UCMSC）是近年来研究最多的成体干细胞之一。不论是科学研究还是临床应用，分离获得足够数量的UCMSC都是最关键的第一步。根据前一章节介绍的技术方法体系，我们可以从脐带组织中分离扩增到大量贴壁快速生长的成纤维细胞样细胞，那么，获得的这些细胞是不是就是UCMSC呢？质量如何？可否用于科学研究甚至临床应用？要回答这些至关重要的科学问题就必须建立包括UCMSC的鉴定、保存、检验、监管等一系列技术方法在内的质量控制与管理体系。

确保脐带质量合格、细胞分离扩增操作规范、细胞制备用品及操作环境合格是分离获得UCMSC的三个关键环节。UCMSC制备必须严格遵循国家卫生健康委发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》、中国医药生物技术协会发布的《干细胞制剂制备质量管理自律规范》、国际干细胞协会发布的《干细胞临床转化指导原则》及国际细胞治疗协会提出的“定义间充质干细胞的标准”等干细胞研究规范，UCMSC的鉴定、检验、监管等质量控制与管理也离不开这些技术规范，只有严格执行这些行业标准和技术规范，再加上严格质量控制与管理才能确保获得的这些细胞是合格可用于科学研究甚至临床应用的UCMSC。

UCMSC质量控制的第一个重点就是排除微生物污染。无论UCMSC仅用于实验研究，还是作为生物制剂用于临床治疗，排除微生物污染都是最基本的要求，是UCMSC产品质量控制的第一要素。因为一旦UCMSC被微生物污染，一方面预示着UCMSC不能被继续培养、只能被迫终止实验，另一方面相当于UCMSC中混入了微生物这些“有害物质”，微生物本身及其代谢或分泌的诸多有害产物直接破坏了细胞纯度、活性等细胞质量，如果用于动物实验将直接危害实验动物的生命，更不用说用于临床试验了。换句话说，如果制备的UCMSC活性差点，可以算是次品，如果制备的UCMSC被微生物污染了，只能算是废品。微生物的种类繁多，千差万别，有些还具有致病性，对于一种活细胞样本来讲，目前的技术手段还难以一次性排除所有微生物，甚至还有未知病原微生物难以判定。检验和排除UCMSC的所有病原微生物，首先要从材料来源着手，检测和选择不携带病原微生物的材料或试剂用于分离培养或冻存细胞，其次是对制备过程中的中间产物和终产品进行病原检测，排除操作过程的污染可能及原材料中未检测出的病原微生物。

排除UCMSC携带病原微生物的重点环节是对产妇进行产前健康体检，排除携带某些特定病原微生物的可能，同时还要注意排除病原微生物潜伏期感染的可能，一般应在第1次检测后2个月再次复检。在UCMSC于体外培养过程中和入库前，可以对培养上清或细胞裂解产物进行病原微生物检测，尽可能排除细胞产品携带病原微生物的可能。检测病原微生物的种类和方法是排除UCMSC携带病原微生物中值得研究的问题，在排除病原微生物种类上应考虑临床常见的具有传染性的重要病原微生物，如乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等，在检测方法上应选择灵敏度高、重复性和稳定性好、简便易行的标准化方法。未来的发展方向是采用生物芯片（基因芯片和蛋白芯片），可以实现高通量检测，一次性排除成千上万种病原微生物。在实际操作中，为保证检测结果的准确性，应采用多种方法同时进行，同时选择权威机构和多家实验室进行检测，结果一致说明准确可靠。

从实际情况来看，能够在体外培养条件下稳定生长的细胞一般不会携带细菌类病原生物，因为一旦有细菌污染，培养体系的性质会很快发生改变而导致细胞死亡。因此，体外分离和传代培养出来的UCMSC应该不会有携带细菌的可能。体外传代培养的细胞如果有真菌类病原污染，一般肉眼可见，细胞也难以稳定生长，排除方法相对简单。关于支原体和衣原体污染问题，由于其比细菌和真菌类更微小，虽然在短时间内不会出现培养液混浊、颜色变化、絮状物等，肉眼可能难以鉴别，但污染了这类病原微生物的细胞随着培养时间的延长，培养体系中会出现泥沙样沉积物，细胞变性、坏死、漂浮，难以在体外稳定生长。因此，大多数细菌、真菌、支原体类病原体可以从UCMSC在体外培养条件下的生长特性、细胞形态、活性状态等方面进行判定和排除。在UCMSC质量控制体系中，需要通过检测分析和鉴别排除的病原微生物重点是病毒类，因其属于微观粒子，可能在细胞内生长，肉眼和普通光学显微镜下难以观察到，只有利用电子显微镜观察、基因扩增、免疫学检测等方法才能分辨出来。排除UCMSC中的病毒，常用的方法是用标记抗体或抗原进行特异性抗原抗体反应，通过标记物分析判定样本中是否含有病毒抗原或抗体，具体包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、免疫胶体金标记技术（ICS）等。病毒DNA检测也常用于血液样本和培养物中特定病毒的检测，其方法主要有：①设计病毒特定基因引物，采用酶联聚合反应（PCR）扩增，凝胶成像观察；②用标记的DNA分子作探针，通过DNA分子杂交方法，鉴定样本中的特征性遗传信息；③基因芯片检测：该方法是根据基因探针杂交的原理，将病毒特异性核酸探针固定于基片上，通过核酸杂交反应后确定标记物的颜色强度判定样本是否含有特定病毒和病毒载量；④蛋白芯片检测：利用抗原抗体反应的原理，将标记抗原或抗体固定于基片上，通过与样品进行反应后，通过观察标记物的颜色强度判定样本是否含有特定病毒和病毒载量。利用免疫电镜技术可以对细胞内病毒进显色、定位和判定病毒载量，该技术是将免疫化学技术与电镜技术相结合，在超微结构水平观察抗原、抗体结合定位，主要有免疫胶体金技术、免疫酶标技术、免疫铁蛋白技术等。排除体外制备的UCMSC的病原，主要参考临床输血的病原检测方法和标准，重点检测病原体包括：艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎（HCV）、鼻炎癌病毒（EBV）、巨细胞病毒（CMV）及梅毒螺旋体（treponemapalidun）等。为排除携带病毒的潜伏期，应在产前、产后60天分别采集妊娠妇女外周血进行上述病原检测，如果产后60天采血难以实现，也可在产前增加采血量，留取部分样本置于4℃条件下放置60天后检测。UCMSC入库前可再次复检，方法是采用超声破碎法或反复冻融法破碎细胞，离心获取上清液，采用DNA测定法或ELISA法检测上清液中是否含有病原体抗原。

目前，关于细胞制品的病原微生物检测尚缺乏强制性和公认的技术标准，一般主要参照临床输血标准执行，但这一标准的检测指标较少，技术方法相对滞后。在实际操作中，UCMSC制备实验室在进行质量检验时，应尽可能扩大病原微生物的检验种类，采用现代检测技术，最好是采用多种方法检测，如果结果一致，则说明可信度高。

利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在标本核酸纯化之后，通过PCR对HBV DNA进行快速定量检测。另外，试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

最低检出限浓度30IU/ml，线性范围100~5×10 ⁸ IU/ml。

细胞培养上清液。

室温放置不超过8小时，4~8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

　ViiA7 DX型核酸扩增荧光检测仪、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。

DNA提取液Ⅰ（4.5ml/瓶）、阴性质控品（250μl/管）、强阳性质控品（250μl/管）、临界阳性质控品（250μl/管）、阳性定量参考品（250μl/管）、内标溶液（100μl/管）HBV-PCR反应管各20支。

根据当次实验标本量，取出需要的PCR反应管为n（n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品）（定性检测无需做阳性参控品），转移至样本制备区。

1） 将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。

2） 取200μl样品，加入450μlDNA提取液Ⅰ和4μl的内标溶液，用振荡器剧烈振荡混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理（10±1）分钟。

3） 12 000g离心5分钟，备用。

往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各20µl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区将各反应管带入PCR仪。

1） 打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow）、阳性定量参考品（Standard），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。

2） 打开instrument窗口，设置循环条件如下：93℃ 2分钟，93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环，93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环。保存文件，运行。

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的起始值、终止值以及阈值（用户可根据实际情况自行调整，起始值可以在3~15，终止值可设在5~20，在Log图谱窗口设置阈值的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果，记录未知样本数值（C）。

FAM检测通路扩增曲线无对数增长期或CT值等于30，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期。

FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期且CT值≤45，HBV强阳性质控品定值范围在2.0×10 ⁵~8.0×10 ⁶IU/ml；HBV临界阳性质控品定值范围在3.0×10 ²~1.0×10 ⁴IU/ml。

FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S形曲线，CT值<29，且R2≥0.98；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

1） 如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判样品的HBV DNA浓度小于检测极限。

2） 如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且CT值小于30，则按以下方法判断：①若样品的C<100，则该样品的HBV DNA浓度<100 IU/ml；如有扩增曲线，建议2个月以后复查；②若样品的100≤C≤5.00E+008，则该样品的HBV DNA浓度=C IU/ml。③若样品的C>5.00E+008，则该样品的HBV DNA浓度>5×10 ⁸ IU/ml。如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HBV DNA浓度=（C×稀释倍数）IU/ml。

《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》《ABIVii7型核酸扩增荧光检测仪操作程序》。

利用实时荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，用于血浆标本中HCV的定性检测。另外，试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。使用试剂盒提供的核酸提取试剂对临床样本进行处理和核酸提取，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配置成PCR反应管，将提取后的核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行一步法PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT值）实现对未知样本的定性检测。

最低检出限浓度500IU/ml，线性范围1000~1×10 ⁸ IU/ml。

细胞培养上清液。

室温放置不超过8小时，4~8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

无菌离心管和无菌真空管。

　ViiA7 DX型核酸扩增荧光检测仪、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。

离心柱（20个/包）1包、收集管（80个/包）1包、裂解液（4.4ml/瓶）1瓶、抑制物去除液（7ml/瓶）1瓶、去离子液（4.4ml/瓶）1瓶、洗脱液（3ml/瓶）1瓶、蛋白酶K（22mg/瓶）1瓶、Carrier RNA（155μg/管）1管、HCV内标溶液（100μl/管）1管、HCV反应液A（270μl/管）1管、HCV反应液B（30μl/管）1管、阴性质控品（200μl/管）1管、HCV强阳性质控品（200μl/管）1管、HCV临界阳性质控品（200μl/管）1管。

1） 抑制物去除液（浓缩液）中加入4.3ml的无水乙醇，并在管盖及管壁上打勾，室温保存。

2） 去离子液（浓缩液）中加入17.6ml的无水乙醇，并在管盖及管壁上打勾，室温保存。

3） 蛋白酶K（干粉）中加入1.1ml的洗脱液，充分混匀，溶解。-20℃保存。

4） Carrier RNA（干粉）中加入110μl的洗脱液或内标溶液（PCR试剂盒中成分），充分混匀，溶解，-20℃保存。（Carrier RNA为白色或半透明物质，仔细检查，确保其完全溶解）。

5） 进行实验前须将裂解液与Carrier RNA进行混合（现配现用），配置成裂解工作液，比例如表6-1。

将待测样本与阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品进行同步处理。

1） 在1.5ml的无菌离心管内加入50μl的蛋白酶K。

2） 取 200μl样品加入离心管中。

3） 再加入200μl的裂解工作液（即已含Carrier RNA的裂解液），盖紧管盖，漩涡震荡15秒以充分混匀，高速离心10秒（防止温育时产生气泡），72℃ 10分钟，同时可将洗脱液置于72℃预热。

4） 加入 250μl乙醇，盖紧管盖，漩涡震荡 15 秒。

5） 将混合液全部吸至离心柱，室温下12 000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

6） 将500μl的抑制物去除液加入离心柱，室温下12 000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

7） 将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

8） 再次将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集

9） 将离心柱-收集管于室温下14 000rpm离心3分钟以去除残余的乙醇。

10） 将离心柱取出，放置于新的1.5ml离心管，打开离心柱盖子，72℃预热的洗脱液50μl，盖紧管盖，室温静置1分钟后，14 000rpm离心1分钟，离心管内即为核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-20℃。

往上述HCV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HCV阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品和直接加入HCV阳性定量参考品20µl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

1） 将反应管放入仪器样品槽内。

2） ABI Vii7仪器设置：①打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow）、阳性定量参考品（Standard），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：TAMRA，Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none，Passive Reference：NONE。②打开 instrument窗口，设置循环条件如下：50℃ 15分钟，1个循环；95℃5分钟，1个循环；94℃ 15秒→55℃ 45秒（收集荧光），45个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的起始值、终止值以及阈值（用户可根据实际情况自行调整，起始值可以在3~15、终止值可设在5~20，在Log图谱窗口设置阈值的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击“Analysis HCV”，自动获得分析结果，在Report界面察看结果，记录未知样本数值（C）。

FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期。

FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S形扩增曲线，且强阳性和临界阳性质控品的定值分别在8.0×10 ⁴~2.0×10 ⁶IU/ml、8.0×10 ³~2.0×10 ⁵IU/ml。

（1） 如果FAM检测通道无对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判样品的HCV RNA浓度小于检测灵敏度。

（2） 如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S形曲线，且CT值≤36则按以下方法判断：

1） 若样品的C<1.00E+003，则该样品的HCV RNA浓度<1×10 ³IU/ml；如有扩增曲线，建议2个月以后复查。

2） 若样品的1.00E+003≤C≤1.00E+008，则该样品的HCV RNA浓度=C IU/ml。

3） 若样品的C>1.00E+008，则该样品的HCV RNA浓度>1×10 ⁸IU/ml。如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HCV RNA浓度=（C×稀释倍数）IU/ml。

《丙型肝炎（HCV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书》《ABIVii7型核酸扩增荧光检测仪操作程序》。

试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增检测EB病毒（EBV）DNA。

最低检出限浓度5×10 ³基因拷贝/ml，线性范围5×10 ³~5×10 ⁷基因拷贝/ml。

脐带间充质干细胞悬液。

标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待检，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰盒。

ViiA7 DX型核酸扩增荧光检测仪、混匀器、冰箱、生物安全柜、紫外灯。

DNA提取液（500μl/管）、PCR反应管、阴性质控品（150μl/管）1管、临界阳性质控品（200μl/管）、强阳性质控品（200μl/管）、EBV阳性定量标准品（1×10 ⁴~1×10 ⁷基因拷贝 /ml，10μl/管）4 管。

（1） DNA提取：阴性质控品处理：

1） 取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。

2） 12 000rpm离心5分钟，备用。

（2） 标本处理：

1） 取全血1ml至干燥玻璃管试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀。

2） 取干燥玻璃管试管加入500μl淋巴细胞分离液。

3） 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁，速度要慢）。

4） 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）。

5） 吸取白细胞层（从上往下的第二层），加入1.5ml离心管，12 000rpm离心5分钟。

6） 弃上清，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。

7） 12 000rpm离心5分钟，备用。

（3） EBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）。

（4） EBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）。

（5） EBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用。

（6） PCR 扩增：

1） 加样：①单管单人份：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液2μl或阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。②大包装：按比例（EBV PCR反应液40μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中，备用。向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液2μl或阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

2） 编辑：①按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量参考品及未知标本（含临界、强阳性质控品），并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，点击工具栏P键，选择PR1 Primer1后关闭窗口。选择工具栏中Q键，输入对应阳性定量参考品浓度。②打开instrument窗口设置循环条件：93℃ 2分钟，93℃ 45秒 →55℃ 60秒→ 10个循环，93℃30秒→55℃ 45秒→30个循环。保存文件，运行。

3） 结果分析：①反应结束后保存检测数据文件。②分析条件设置：根据分析后图像调节Basement的start值、stop值以及Threshold的Value值（可根据试剂情况自行调整，start值可以在1~10、stop值可以在5~20、Value值可以在0.01~0.2范围选择），使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0~-0.97，在Analisis菜单下选择Analyze自动分析结果。③到Tray窗口，记录未知标本数值。④记录Calculated concentration下面一起自动分析计算出的未知标本数值（C）。

（1） 阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或CT值=30。

（2） 阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考值在6.310×10 ⁶~1.000×10 ⁸基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在6.310×10 ³~1.000×10 ⁵基因拷贝/ml范围。

（3） 阳性定量参考品，增长曲线呈S形，CT值<27。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。

如果增长曲线不呈S形曲线或CT值=30，则实验结果判为样品的EBV DNA含量小于检测极限。如有扩增曲线，建议2个月以后复查。

如果增长曲线呈S形曲线且CT值<30，则实验结果按以下方法判断：①若样品的C<5.00E+003，则全血样品EBV DNA总含量<5.0×10 ³基因拷贝/ml；②若样品的5.00E+003≤C≤5.00E+007，则全血样品EBV DNA总含量=C基因拷贝/ml；③若样品的C>5.00E+007，则全血样品EBV DNA总含量>5.0×10 ⁷基因拷贝/ml。

《广州达安EB病毒荧光定量检测试剂盒说明书》《ABI Vii7荧光定量PCR仪标准操作及维护程序》。

本品选取人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp，利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。

最低检出限浓度为10 ⁴copies/ml。

细胞培养上清液。

室温放置不超过8小时，4~8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。

DNA提取液（500μl/管）2管、CMV-PCR反应管20管、阳性定量参考品（2×10 ⁸copies/ml）（50μl/管）1 管、弱阳性质控品（200μl/管）1 管、强阳性质控品（200μl/管）1管、阴性质控品（50μl/管）1管、稀释液（500μl/管）1管。

吸取上清（注意勿细胞）至无菌1.5ml eppendoff管，即为血清标本。取50μl血清加50μl DNA提取液打匀，100℃保温10分钟，12 000rpm离心5分钟，取上清液（含病毒DNA）5μl做PCR扩增。

质控品加50μl DNA提取液打匀。100℃保温10分钟（误差不超过1分钟），2000rpm离心5分钟，取上清液5μl做PCR扩增。

将阳性定量参考品（2×10 ⁸copies/ml）6000rpm离心数秒标示为10 ⁸，另取4支灭菌新0.5ml离心管，分别加入90μl稀释液，依次标示为10 ⁷~10 ⁴。吸取10 ⁸管10μl至10 ⁷管，用加样器反复混匀后换新吸头取10μl至10 ⁶管，依此方法依次稀释至10 ⁴管。-20℃保存；吸取5个（2×10 ⁸-2×10 ⁴copies/ml）的阳性定量参考品梯度和阴性质控品各40μl，分别加40μl DNA提取液打匀，以下步骤同样本处理。上清液（含病毒DNA）待用于PCR扩增。

取CMV-PCR反应管若干，分别加入处理后上清液（含病毒DNA）各5μl，6000rpm离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的孔样品槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量质控参考品梯度（应设置为10 ⁸~10 ⁴copies/ml）以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃ 60秒，先做10个循环，最后按93℃ 30秒→55℃ 45秒，做30个循环。

反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（2~4），stop值（7~9）以及Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于r值），最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty）。

1） 阴性质控品：全部阴性。

2） 阳性定量参考品：全部阳性|r|≥0.97（correlation数值等同于r值）。

3） 弱阳性质控品数值范围：2.5×10 ⁴~4×10 ⁵拷贝/ml。

4） 强阳性质控品数值范围：2.5×10 ⁶~4.×10 ⁷拷贝 /ml。

以上要求需在同一次试验中同时满足。否则，本次试验无效，全部试验应重新进行。

如果增长曲线不是典型的S形曲线或CT值=30，则实验结果判为小于10 ⁴copies/ml。

如果增长曲线呈典型的S形曲线且CT值<27，则实验结果判为阳性。样品的HCMV DNA含量（copies/ml）=Qty/20。若样品为血清，则样品中的CMV DNA 含量（copies/ml）=Qty。

《人巨细胞病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》《ABI PRISM 7000荧光定量PCR检测仪操作程序》。