UCMSC的分离是指采用机械、酶消化或组织培养法等获得单细胞悬液，然后通过贴壁培养的方法从中纯化获取间充质干细胞的过程。由于间充质干细胞具有贴壁生长的特性，尤其在塑料培养瓶中生长良好，因此可利用简单的塑料培养瓶进行贴壁培养即可去除大部分的杂细胞，获得纯度相对高的UCMSC。采集获得的新鲜脐带组织，用生理盐水或平衡液洗涤，必要时用含有青霉素/链霉素的生理盐水或平衡液（双抗）浸泡5~10分钟以便将污染风险降到最低，再用组织均浆器粉碎或眼科剪剪碎或将组织置于液氮中研磨碎（剪碎前通常以机械方式剥离脐带外膜和血管），然后进行原代分离培养。原代分离常用的方法有微组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法、改良胶原酶消化法等。为去除杂质，通过匀浆或酶消化后的细胞悬液，一般应采用100目的滤网进行过滤后再用于分离培养。间充质干细胞的纯化主要采用贴壁传代培养、差速贴壁、流式细胞分离术、免疫磁珠分离法等方法，可获得纯度大于99%的相对均一的间充质干细胞。为了获得合格的UCMSC，必须在合格的操作环境（如细胞工程实验室百级操作台）下使用合格的细胞制备用品（如无菌的培养液、无毒的细胞培养瓶等），由具备细胞制备技术操作技能的工作人员严格按照细胞分离扩增操作规范进行。因此，分离扩增UCMSC必须从源头开始建立质量标准和技术规范。

超净工作台、倒置照相显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、解剖显微镜、共聚焦显微镜、电子显微镜、CO ₂培养箱、低速大容量多管离心机、普通冰箱、超低温冰箱、程序降温系统、制冰机、酶标仪、染色体分析系统、细胞计数仪、PCR仪、基因测序系统、凝胶成像系统、超滤系统、纯水系统、PH计、电子称、平衡称或天平、高速离心机、高压蒸气消毒装置、点热干燥箱、恒温水浴箱、微孔过滤器、移液器（1~1000μl）。

T175塑料培养瓶、T75塑料培养瓶、T25培养瓶、培养皿、塑料离心管（5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、250ml）、EP 管、细胞冻存管、一次性移液管、移液器枪头、乳胶手套、吸球、酒精灯、小型手术包（剪刀、镊子、眼科剪、眼科镊、止血钳、刀片等）、纱布、棉球、搪磁盘、杂物缸等。进入细胞工程实验室的所有耗材必须是无菌的合格产品。

DMEM/F12培养基、EDTA-0.25%胰酶、NaHCO ₃、胎牛血清（FBS）、青霉素（80万U）、链霉素（100万U）、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、去离子无菌水、生理盐水、人血白蛋白、复方电解质冻存液、酒精、消毒液、pH试纸。进入细胞工程实验室的所有耗材必须是无菌的合格产品。

基础试剂的准备：

用电子天平称取NaHCO ₃6.6g，加入灭菌注射用水定容至100ml，在细胞层流室内超净工作台上用高压灭菌过的0.22μm的滤膜过滤除菌后备用。

无菌条件下在500ml基础DMEM-F12培养液中加入55ml胎牛血清，再用6.6%NaHCO ₃溶液调节pH值至7.4后备用。

将青霉素（80万U/瓶）溶解于4ml灭菌注射用水中，链霉素（100万U/瓶）溶解于4ml灭菌注射用水中，两者混匀后按照1ml/支分装备用，使用时每升培养液加入1ml。

含20%FBS和含10%DMSO的完全DMEM-F12培养液。

由具有细胞生物学专业知识背景和实践操作经验的技术人员完成脐带间充质干细胞的制备。严格按照实验室运行管理及操作流程、规范进行，特别需要遵守如下要求：

1.从事UCMSC的技术人员必须每半年进行1次健康体检，传染性疾病患者不得参与UCMSC制备操作。

2.进入细胞制备实验室的人员必须遵守实验室操作流程和规范，服从实验室管理人员的监督管理。

3.严格实行物流通道和人员进入通道分开的管理制度，严禁不合格的器材和培养试剂进入实验室而造成污染。

4.培养液的配制和细胞分离等开放性操作只能在100级超净工作台上的酒精灯前无菌区进行。

5.严格执行脐带间充质干细胞分离培养操作程序，避免延时操作而影响细胞活性。

6.必须使用洁净无菌的玻璃吸管等器材，严防交叉污染。

7.必须确保使用的材料合格有效。

8.严禁使用包含非临床应用制剂或可能导致细胞遗传特性改变成分的条件培养基。

9.操作过程中应特别注意注明和核对标签，确保样本处理过程中的编号或标识前后一致。

10.入库或提供临床使用的脐带间充质干细胞制剂必须无菌分装，分装容器必须无毒性、无污染，标明名称、体积、数量、活性、批号、制备人等，同时留样长期储存备查，所有技术资料应完整和可溯源。

1.在无菌条件下取脐带一根，转移入50ml离心管中加入生理盐水反复冲洗3遍以上，最后用双抗水浸泡5~10分钟，用生理盐水冲洗干净后，在无菌的培养皿中，用镊子配合剪刀去除被膜、血管等，再用生理盐水冲洗去除血液和杂质。如果是制备临床应用细胞，必须是取自检查合格的脐带，最低检测标准至少应符合临床输血要求，HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性的健康产妇。

2.用高压灭菌过的眼科虹膜剪将组织分离为0.5cm长的组织块若干，再将组织块转移至一个1.5ml EP管内，用虹膜剪将EP管内的组织剪碎至糊状，一般使组织块在1mm ³以下。

3.加入等量DMEM/F12基础培养基，直接将EP管内的糊状组织接种于培养瓶中，一个EP管对应一个T175的培养瓶，然后加入10ml已调整好pH值的含10%FBS的完全DMEM-F12培养液，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5%CO ₂、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。

4.静置培养24小时后，在倒置显微镜下观察，组织块贴壁牢固后，可补加完全培养基10~15ml之后3~4天换1次培养液，静置培养7~9天后，可见大量细胞贴壁。此时，用吸管轻轻吸出一半培养液，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，吸弃上清和悬浮组织块并接种于新培养瓶中加入新鲜10%FBS的完全DMEM/F12培养液继续进行贴壁培养，密切观察细胞生长情况，依据细胞生长情况每隔3~4天换液1次。

5.第1次贴壁培养成功并更换培养液时，可用吸管反复吹打，使微组织快脱落，再将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养。同一脐带组织块至少可反复进行3次重复贴壁培养，即可获得常规培养3倍数量以上的原代UCMSC。

6.脐带组织块培养后2周左右，细胞可长满瓶底，达到80%以上融合，此时可用吸除培养基，加入适量0.25%的胰酶，充分摇晃均匀，置于37℃培养箱中放置5分钟，注意观察细胞形态变化，发现细胞收缩，摇晃培养瓶有片状细胞脱落时，立即加入含10%血清的培养液10~15ml终止反应，用吸管吹打使细胞完全脱落，然后将细胞悬液移入离心管中，300~400×g离心10分钟，再加入生理盐水10ml，离心洗涤，反复3次后，计数活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。

7.传代培养通常采用专用细胞培养瓶，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1∶3的比例进行传代培养。作者所在实验室创建了一种以脐带组织块培养法为基础的高效、大规模体外制备技术，组织块可反复接种培养3次以上，获得原代细胞的数量在1×10 ⁹个细胞以上，传代培养至第3代，可获得3.6×10 ¹⁰个细胞。

8.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题，也是影响细胞质量的深层次问题。国外对骨髓间充质干细胞体外长期培养研究发现：如果在体外连续传代培养60次以后就会观察到间充质干细胞衰老和自动向脂肪细胞分化。笔者长期培养实验证明：在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后，个别细胞会发生染色体变异。

除了上述组织贴块法分离培养脐带间充质干细胞之外，还可以采用胶原酶、胰酶混合消化法制备脐带间充质干细胞：胶原酶消化法是组织块贴壁法的延伸方法，起初步骤与组织块贴壁法相同，只是脐带剪成1mm ³大小的组织块后将组织块转入1g/L的胶原酶Ⅳ中，37℃孵育搅拌消化30分钟后，随即用1g/L的胰酶消化30分钟，再用完全培养基终止消化，经200目筛网过滤消化液，离心弃上清，生理盐水洗涤2次，调整细胞接种密度为1×10 ⁵个/ml接种到含DMEM/F12培养基的T175塑料培养瓶中，5%CO ₂ 37℃静置培养48小时后换液，除去未贴壁的细胞，原代呈梭形、纤维样细胞，3~4天细胞可克隆样生长，5~6天后细胞传代逐渐融合达70%~80%时呈匀质、涡旋状排列生长。

酶消化法和组织贴块法是分离培养UCMSC两种基本方法，但酶消化法存在酶的浓度和消化时间控制不好就可能会损伤细胞膜、降低细胞活性甚至改变细胞功能，而且操作烦琐，这不符合组织培养的基本原则，因为操作越烦琐，污染的机会就越多，细胞突变的概率也越大。从简单、方便的组织培养原则出发，组织贴块法优点更多：①方法简单：直接剪碎脐带为糊状直接培养，操作步骤少，大大缩短了实验室处理的时间，而且分离方法容易标准化；②经济实用：分离培养UCMSC的过程中不使用胶原酶，分离成本低；③安全性好：与所有干细胞一样，如何防范UCMSC在分离培养过程中的污染和变异一直是人们关注的一个重点。怎样才能最大限度地降低干细胞污染和变异的风险呢？尽量减少对干细胞的干预处理就是最大限度地降低干细胞污染和变异的根本方法，比如简化体外分离操作环节，就可大大降低污染的概率，比如减少各种“外来物质”的接触，这也是《人的体细胞治疗申报临床试验指导原则》的基本要求——尽量避免异体血清、细胞因子、抗生素等“外来物质”的使用，当然酶消化法中常用的各种酶也属于“外来物质”的范畴，减少这些“外来物质”的使用和接触，既可降低细胞变异的概率，又可有效防止各种病原微生物的传播。

继续进行传代培养的细胞可用完全培养基稀释后接种于新培养瓶中进行扩增培养，用于储存的UCMSC需添加冻存液后保存备用。为维持细胞的活性，长期低温冻存UCMSC时，冻存液需要在完全培养基的基础上添加保护剂。常用的细胞渗透保护剂有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙二醇、丙二醇、乙酰胺等，渗透性冷冻保护剂可在细胞悬液冻结凝固之前，渗透到细胞内，维持冻存过程中的细胞内外电解质平衡，保护细胞免受高浓度电解质的损伤，使细胞内的水分不会过分外渗，从而使细胞内外的渗透压基本一致。本实验室使用的间充质干细胞冻存液是在完全培养基（DMEM/F12培养基、25%胎牛血清、SCF 50ng/ml、FGF 50ng/ml、bFGF 50ng/ml）的基础上添加2%人血白蛋白、10%二甲基亚砜作为细胞保护剂，方法是用该冻存液将细胞稀释成5×10 ⁶细胞/ml的密度，分装于冻存管中，贴上标签，置于程序降温仪中，渐进降温，最终于-196℃的液氮中长期冻存。用于临床治疗的脐带间充质干细胞可用含2%人血白蛋白的复方电解质平衡液1ml稀释，计数细胞密度和活细胞比例后，继续稀释成（1~3）×10 ⁶细胞/ml，分装于专用塑料输血袋中，标签注明细胞类型、数量、体积、密度、批号、制备人等基本信息，传递出实验室备用。UCMSC冻存操作步骤如下：

（1） 向离心洗涤后的UCMSC加入冻存液，轻轻震荡或吹打使细胞混匀，计数活细胞数量及计算密度。

（2） 用冻存液稀释成5×10 ⁶个细胞/ml。

（3） 将细胞悬液分装于2ml体积的专用冻存管内，细胞悬液的分装体积按冻存管容量的2/3计量，不宜加满，以免膨胀爆裂，然后拧紧瓶盖，贴上标签，标明细胞名称、代数、密度、批号、制备人、制备日期等信息。

（4） 遵循“慢冻快融”的原则，将装有（1~3）×10 ⁶细胞/ml的冻存管置于程序降温系统中，降温速度1~2℃/min，当温度低于-25℃后，降温速度可加快至5~10℃/min，当温度下降至低于-80℃后，直接进入液氮中长期储存。程序降温系统是在液氮冻存灌的基础上设计安装了自动降温控制系统，按操作要求放置冻存管后即可自动降温。

（5） 对于没有自动降温控制系统的UCMSC冻存，可将冻存管放入普通冰箱的4℃冷藏室中静置30分钟，然后转移到冷冻室（-10~20℃）中放置1~2小时，再转移至超低温冰箱（-70~80℃）中放置过夜，最后将冻存管放入液氮中保存。如果没有超低温冰箱的话，可将冷冻室（-10~20℃）中放置后的冻存管置于液氮罐的液氮上方的入口附近过夜后再置于液氮中。

UCMSC可在-70~80℃条件下储存3~6个月无明显活性下降，但长期储存必须置于液氮中。冻存剂中的DMSO不能防止细胞内的水分结冰，因此需要一定时间的预冷，使其进入细胞内并在细胞内外达到平衡，以起到充分的保护作用。配制DMSO时，应使用临床级DMSO，采用过滤法除菌，不能采用高压灭菌法，因为DMSO本身具有一定的杀菌作用，高压灭菌会破坏其分子结构，导致冷冻保护效果降低。DMSO在低温条件能够保护细胞并且毒性较低，但在常温条件下则对细胞有一定毒性作用，操作中应注意戴手套防护。在冻存UCMSC的过程中，特别是人站在液氮储存系统附近操作时应戴手套、眼镜、穿工作服，动作要轻，小心液氮溅出造成冻伤。

UCMSC的复苏应以很快的速度升温，在1~2分钟内达到恢复到常温水平，防止细胞内形成冰结和高浓度电解质而对细胞造成损伤。由于DMSO在常温下对细胞有一定毒性作用，复温后的细胞悬液立即处理，通过离心洗涤尽快去除DMSO。冷冻保护的效果与冷冻速度、冷冻温度和复苏温度有密切关系，只要操作得当，复苏后的UCMSC仍然保持其正常的结构与功能，体外生长特性不发生明显改变。UCMSC的复苏方法如下：

1.在实验内预先准备40℃水浴（用100ml塑料烧杯装40℃温水50ml）、镊子（用于转移冻存管）、10ml离心管、0.9%的生理盐水、DMEM/F12培养基、胎牛血清或人脐血血清、SCF、EGF、bFGF、吸管、移液管、一次性吸头、培养瓶等。

2.从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入温水中，轻轻摇晃使冻结细胞在2分钟左右融化。为保证细胞的活性，可将冻存管置于-80℃冰箱中放置30分钟，使液氮蒸发后再转入温水中，同时避免冻存管爆裂危险。

3.将融化后的细胞迅速转移至超净工作台，用酒精棉球将冻存管擦拭干净，用吸管将细胞悬液转移到离心管中，加入5ml预热至37℃的培养液，加入1ml培养液至冻存管中冲洗管壁并转移至离心管中，反复冲洗2次，轻轻振荡混匀试管内的细胞悬浮液。

4.300g离心10分钟，用吸管去除上清，加入3ml完全培养基，轻轻震荡或吹打使细胞重悬混均匀。

5.计数活细胞数量和比例，将细胞悬液接种于T75塑料培养瓶中，加入20ml完全培养基。

6.摇晃培养瓶使细胞均匀分布于瓶底，将细胞置于37℃、5%CO ₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。

7.每3天观察细胞生长情况并换液，也可在第2天细胞贴壁后换1次液，好处是可以去除死细胞及其对正常细胞的影响。待细胞生长至80%~90%融合时收集细胞，按常规弃培养上清，用平衡液或生理盐水洗涤，胰酶消化，离心洗涤，计数活细胞，用完全培养基稀释，按1∶3的比例接种于新培养瓶中进行传代培养，收集1瓶UCMSC后，接种于3个相同面积的新培养瓶。

8.传代培养后的UCMSC生长速度远快于原代UCMSC，一般4~5天即可达到80%~90%的细胞融合度，此时可继续收集、继续传代培养或冻存。