第五章　脐带间充质干细胞的分离和扩增

脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，呈灰白色，平均长度约50cm，最早由英国解剖学家Thomas Wharton于1656年最先描述了脐带的主要结构，因此脐带外层和脐带血管之间的结缔组织被称之为华尔通胶（Wharton jelly），内含大量间充质干细胞被研究发现，脐带成为了近些年来间充质干细胞最主要的来源、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesnchymal stem cell，UCMSC）也成为研究最多的成体干细胞之一。

不论是科学研究还是临床应用，分离获得足够数量的UCMSC是最关键的一步。确保脐带质量合格、细胞分离扩增操作规范、细胞制备用品及操作环境合格是分离获得UCMSC的三个关键环节。参照国家卫生健康委发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》、中国医药生物技术协会发布的《干细胞制剂制备质量管理自律规范》、国际干细胞协会发布的《干细胞临床转化指导原则》及国际细胞治疗协会提出的“定义间充质干细胞的标准”等干细胞研究规范，建立了UCMSC的分离、扩增、鉴定、冻存等技术体系。

原材料的质量是决定UCMSC能否分离成功、影响UCMSC质量能否过关的基础。因此，首先要把好脐带来源及采集的质量关。UCMSC属于遗传资源，受国家遗传资源保护相关法规或条例的限制，不论是用于科学研究还是治疗应用，应在实施采集、制备、储存之前，按照国家遗传资源样本采集、储存和使用管理的要求，向政府相关管理部门提供完整的技术资料，经审查批准之后方可实施。在一般情况下，脐带采集及应用还应通过伦理审查，UCMSC制备实验室应按伦理委员会的要求提供详细的技术资料，经过伦理委员会审查并批准后，方可开展脐带采集工作。如果采集人的脐带，必须取得捐献者的知情同意。脐带采集医疗机构按要求要向供者告知注意事项，必须在分娩前得到产妇的同意并签署知情同意书。在采集脐带前按要求填写《脐带供者产妇健康调查表》，做好母婴相关的保密工作，应对脐带捐献产妇在产前结合妇产医院常规检测要求，对产妇进行健康检查，重点排除携带病原微生物的可能性，根据实际进行遗传分析，尽可能排除有遗传变异的UCMSC。为避免携带潜伏期病原，应在产后3个月后再次采集产妇的静脉血6ml左右进行复检，前后结果一致方可确认。对于重点检测指标，脐带采集机构应在自检的基础上，应同时送请第三方权威检测机构进行复核检测，以保证脐带来源的质量和安全性。为防止分娩过程中的脐带污染，一般应采集剖腹产的脐带，胎儿应生长发育状态良好无畸形。虽然许多文献也采用足月顺产的新生儿胎脐带，但发生脐带污染的概率远远高于剖腹产，因为胎儿在经过软产道时容易沾染上软产道的细菌、病毒等微生物，所以在选择脐带时尽量选择剖腹产的。如果采集自然分娩的新生儿脐带，应采取一些必要的防污染措施，将污染的可能性降低到最低程度，分离制备之前采用无菌生理盐水充分洗涤、双抗浸泡等方式作抗菌处理，可以一定程度上降低脐带污染的风险。制备过程中若发现污染，原则上应立即废弃。

脐带采集的操作过程是严防污染发生的关键环节。采集脐带用的物料、容器应使用无菌器材，如果制备临床应用细胞还必须符合临床安全标准，且在有效使用期内。脐带采集前检查采集容器是否完整，封口是否严密。采集脐带时必须无菌操作，应在胎儿娩出后，立即截取脐带并将脐带置于事先分装有基础培养基的无菌塑料采集管内，拧紧采集管的螺旋盖并用封口膜封口，如果脐带较长，可剪断分多个管放置，盖好瓶盖后，在容器外贴上标签，将置于专用运输箱或袋中，尽可能快地将脐带转运到实验室。脐带运输箱的温度一般应维持在4~8℃，可在运输箱内放置干冰以维持低温环境，运输过程中应避免激烈震荡。脐带间充质干细胞制备技术流程如图5-1所示。