外泌体作为细胞信使并用于诊断和治疗效用的功能被重新发现，使其成为近年来研究的热点。而外泌体的研究，不论是针对其内容物还是其功能的研究，其前提都是有效且有选择性的进行外泌体的分离。目前，尚无针对外泌体的定量和定性的有效方法，这会显著影响下游分析结果，使数据难以比较、重现以及对各组分间的结果进行分析，因此，对外泌体及细胞外囊泡的纯化方法进行优化和标准化是外泌体研究领域急需解决的问题。因此，全面理解不同的外泌体分离方法的优劣及其原理是进一步开发外泌体新分离策略的基础，本节将对目前外泌体的方法进行分类小结，并提出一些外泌体的准备策略和对不同的分离方法进行一个比较。目前外泌体分离主要方法包括超高速离心法、密度梯度离心法、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法。此外，也有一些新的方法报道。本节将对这些研究方法进行一一介绍。

收集含有外泌体的条件培养基是外泌体分离工作的基础，而此处所描述的条件培养基的准备工作对于所有的分离方法都适用。在准备条件培养基的同时，应该收集细胞的全裂解液用作后续分析工作的对照。

选择生长状态良好且无污染的脐带间充质干细胞（代数越低其分泌能力越好）铺板，完全培养基培养备用。如果采用超高速离心法分离外泌体，通常需要准备至少70ml的条件培养基方够后续分析鉴定工作的开展。因此，推荐采用15cm培养皿或者T175的培养瓶进行细胞培养。

当细胞覆盖率达到70%~80%时，去除完全培养基，PBS洗3次，尽弃上清，更换为无血清培养基（不含有FBS），此步可以选择商品化的间充质干细胞专用的无血清培养基（含有血清替代物，可以保持干细胞的生长）也可以采用DMEM/F12基础培养基。

在无血清培养体系中继续培养干细胞。对于商品化的无血清培养基，可以根据其相应的说明，调整上述两步。以BI公司生产的无血清培养基为例，可以从细胞传代开始就采用无血清培养体系培养细胞，原则是让最后收集到的条件培养基不含有外源的外泌体成分。

对于培养体系商品化无血清培养体系，由于其培养体系中不含有任何外源外泌体成分，因此可以根据细胞状态收集干细胞培养上清，通常是在细胞长满时收集。而对于不含有FBS的基础培养基，从换上空白培养基开始继续培养细胞48小时后收集培养上清。

用巴士滴管或者吸管（无菌）将条件培养基收集到无菌的50ml离心管中，300×g，4℃，离心 10 分钟，保留上清。

4℃存放可以保存1周，-80℃存放可以保存几个月。但建议将培养基保存在4℃，1周内进行分离提取。因为-80℃保存容易导致外泌体形态上的变化，不利于后续鉴定工作，尤其是电镜鉴定工作的开展。

全细胞裂解液用于后续外泌体分析工作（主要是免疫沉淀实验）的对照，具体实验方法如下：

1.收集细胞　胰酶消化1~2盘/瓶上述用于收集条件培养基的脐带间充质干细胞，终止后计数。

2.离心　将（1~5）×10 ⁷个脐带间充质干细胞收集到15ml离心管中，去上清后用适量PBS重悬细胞，再次300×g，4℃，离心5分钟。去上清，保留沉淀。

3.加入200μl（对应1×10 ⁷细胞数）细胞裂解液，冰上裂解20分钟，在起始和结束裂解时涡旋振荡。

4.收集细胞裂解液，20 000×g，4℃，离心20分钟，保留上清。-20℃或-80℃冻存。

超高速离心法是目前文献上报道最多，被最多研究者采用的分离方法，据调查，约有56%的文献中采用超高速离心法分离外泌体。具体操作步骤如下（图4-2）：①第一步：收集培养上清。对于脐带间充质干细胞，采用无血清培养体系培养细胞48小时后收集培养上清，4℃保存待用（1周以内）或者-80℃长期保存备用。之所以采用无血清培养体系，是因为血清中含有外源外泌体，会带来外源外泌体的污染，直接影响后续分析的结果。②第二步：300×g，4℃，离心10分钟，保留上清。此步骤的目的是去除培养上清中的细胞。③第三步：2000×g，4℃，离心10分钟，保留上清。此步骤的目的是去除上清中的死细胞。④第四步：10 000×g，4℃，离心30分钟，保留上清。此步骤的目的是去除上清中的细胞碎片。⑤第五步：100 000×g，4℃，离心70分钟，保留沉淀。此步骤所得沉淀是外泌体和可溶性蛋白的混合物。⑥第六步：加入预冷的PBS，洗涤沉淀，100 000×g，4℃，离心70分钟，保留沉淀。此步骤所得沉淀即为较纯的外泌体。

值得注意的是，目前超高速离心机生产的厂家不同其对应的转子也不同，不同的转子对应不同的离心力，现将其转速和离心力对应关系列出如表4-1。

对于超高速离心法收集外泌体，有以下几个关键点需要注意：①所有离心的步骤都需要在4℃完成。②除非所收集的外泌体需要用于功能实验（体内实验或者体外实验），否则对于离心管不做无菌要求。但收集外泌体的离心管需要和离心机配套且洁净。③如果收集的外泌体需要做无菌保存，用作相应的功能实验。对于离心所用的离心管、转头和转子都需要用70%的乙醇彻底消毒，离心管还需要进一步用无菌的PBS冲洗2次，并倾倒干净。

下面对超高速离心法的各步骤详细阐述：

（1） 将条件培养基（通常是无血清培养48小时后的细胞培养上清）转移到50ml离心管中。

（2） 2000×g，4℃，离心 20 分钟。

（3） 小心吸出上清，转移到超高速离心机对应的专用离心管中（确保所吸取的上清中不含有任何沉淀。在获取上清时最好使用吸管吸出的方式，而不是倾倒的方式来收取上清，吸取上清时距离沉淀上表面保留约0.5cm时停止吸取，避免吸入沉淀）。

（4） 超高速离心之前用记号笔在超高速离心管的一侧做好标记，离心时将作有标记的一侧朝外，10 000×g，4℃，离心30分钟（做标记的目的是为了在离心结束的时候确定沉淀的位置）。

（1） 将上清转移到新的离心管或者离心瓶中（和第3步中的离心管或者离心瓶型号一致）。此步要确保转移上清的时候不要混入沉淀。本步中所得到的沉淀肉眼不可见，需要根据上一步记号笔标记的位置来确定。对于变角转头，沉淀在离心管底部；对于固定角转头，沉淀在记号笔标记的朝外一侧。转移上清的过程中，手持离心管并保持在一定的角度，保证沉淀始终被上清覆盖的状态，当液面高度仅为0.5cm时即可停止转移上清。

（2） 离心：100 000×g，4℃，至少70分钟。此步为超高速离心，因此所有的离心管中液体体积至少为总体积的四分之三；如果某一管体积不够，可用预冷的PBS补齐。离心的时间以转速达到100 000×g开始计算，值得注意的是，超高速离心机启动后到达100 000g大约需要10分钟，而时间设定时最长不超过3小时，时间长短并不会破坏外泌体的结构，只会影响提取的纯度和产量。

（3） 弃尽上清：对于固定角转头，此步用倾倒的方式优于吸管吸取的方式；而对于变角转头，去除上清时需要注意不要完全去除，保留约2nm的上清更佳。

（1） 用1ml预冷PBS重悬上一步所获得的沉淀，用移液枪进行吹打。将来源相同的重悬液合并到同一个离心管中，然后加入PBS直到充满离心管。此步所获得的沉淀同样不可见。

（2） 100 000×g，4℃，1小时。注意“1小时”指的也是转速达到100 000×g时的保持时间。

（3） 尽可能去除上清：对于固定转头，倾倒上清时保持管口朝下，并用移液枪讲管壁上悬挂的液体吸掉。然后根据需要进行11a或11b所述步骤。

（4） 重悬沉淀（即外泌体）：加入小体积（50~100μl）PBS或者TBS重悬沉淀。如果此步所获得的外泌体悬液的总体积过大（大于原始条件培养基的1/2000体积时）或者在上一步看不见沉淀，可用步骤11b替代此步。

（5） 浓缩外泌体：将步骤10所得上清离心，100 000×g，4℃，1小时，用TLA-100.3的转头和对应的超离管。去上清，观察沉淀，加入20~50μl新鲜配置的PBS重悬沉淀（即外泌体）。

（6） 外泌体的保存：-80℃保存体积为100μl的外泌体悬液保存时间可达1年。注意：避免反复冻融。

注意：对于某些细胞（例如：小鼠的DC细胞），可用0.22μm过滤的方式替代上述方法中的步骤（1）至（6），达到除去细胞、死细胞和细胞碎片的目的。

密度梯度法是在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13~1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤烦琐，耗时，对离心时间极为敏感。和超高速离心一样，密度梯度法所有步骤都要在4℃完成。具体操作步骤如下：

1.按照前述超高速离心法步骤获得初步纯化的外泌体沉淀。

2.用25mlPBS重悬外泌体沉淀。

3.制作垫子　小心加入4mlTris/sucrose/D ₂O溶液到SW28管底部。

4.小心加入外泌体悬液到已经铺有垫子的SW28管液体表面，注意不要破坏垫子表面。100 000×g，4℃，离心 75 分钟。

5.用5ml填充有18-G针的注射器，沿着离心管壁深入垫子，收集3.5ml包含外泌体的Tris/sucrose/D ₂O溶液。

6.将上述3.5ml溶液转移到新的离心管中，加入60mlPBS洗涤。采用45Ti转头，100 000×g，4℃，离心70分钟，去上清，保留沉淀。

7.用50~100μlPBS重悬沉淀，所得沉淀即为与超速离心法相比纯度更高的外泌体。

免疫磁珠法（简称“磁珠法”）是一种简单快速分离外泌体的方法，适合于外泌体的常规分离和分析，基于针对外泌体膜表面的特征性蛋白设计的。外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。另外，该方法证明利用磁珠共沉淀下来的不只是外泌体，还有一些可溶性蛋白，提示我们再进行外泌体蛋白质组学的分析时需要考虑可溶性蛋白的干扰。磁珠法的优点是不依赖于超高速离心机，在普通实验室即可完成；操作简单，特异性高；可以用流式直接分析，能快速获得外泌体不同亚型的分布情况，不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。通常会利用超度离心或者密度梯度法分离得到总的外泌体，进一步用磁珠法分离表面标志物不同的外泌体亚型。具体操作步骤如下：

1.将条件培养基收集到50ml离心管中，2000×g，4℃，离心10分钟。

2.转移上清到新的离心管中，重复上一步。

3.按照包被好抗体的磁珠的使用说明进行操作（例如：用含有3mg/ml BSA的PBS洗5次，每次5ml），利用磁铁进行分离。

4.利用磁铁对磁珠进行富集，并且去除上清，加入步骤2中所获得的条件培养基并重悬磁珠。

5.将管子固定到旋转摇床上室温或者4℃孵育24小时，使外泌体膜上的蛋白和磁珠上对应的抗体充分结合。

6.用磁铁富集磁珠，用2~10ml PBS（含3mg/ml BSA）洗磁珠，至少3次，以减少非特异性结合。

7.用不含BSA的PBS洗1次，以减少BSA的丰度。

8.用100μlPBS重悬磁珠，下游可进行FACS分析或者用密度梯度法进一步纯化，也可直接用SDS样品缓冲液处理后进行免疫印迹分析，或者固定后进行电镜检测。

聚乙二醇（PEG）为常用的多聚物，可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者Tween-20等化学添加物将会破坏外泌体等，影响实验结果。

此处以某公司的产品为例，对其操作流程进行一个简单介绍：

实验前准备：由于FBS中含有丰富的外泌体，这将会给后续实验带来很大的污染，因此用48小时饥饿后的培养基上清，玻璃管，4℃，离心机，0.22μm一次性滤器。

注意：饥饿细胞前要保证细胞状态良好，细胞状态直接关系到外泌体的产量。

1.收集4ml细胞培养上清。

2.3000×g，15分钟4℃离心或者0.22μm滤器过滤。

3.配制反应混合液（A：0.25ml；B：0.25ml；C：1ml），按照 ABC 的顺序加，将混合物剧烈震荡10秒后立即加入上一步准备的培养基上清中；注：使用玻璃管而不是塑料管。

4.剧烈震荡30秒之后冰上静置30分钟。

5.分层后快速去除最上一层和最下一层，将云雾状层立刻转移到1.5ml EP管中，离心5000×g 3分钟；其中最上一层保留作为实验对照。

6.再次分层后去除最上一层和最下一层，将云雾状层立刻转移到0.5ml的EP管中，离心5000×g 3分钟。

7.再次去除最上一层和最下一层，开盖挥发10分钟；但不要让沉淀完全干燥。

8.加入4倍沉淀体积的1×PBS，用枪尖上下混匀40~60次后放在水平震荡仪上最大速震荡10分钟，间隔3分钟上下吹吸40次（这一步非常关键，外泌体可能被包裹在沉淀中难以重悬，造成最后的产量低）。

9. 5000×g，5分钟离心，上清过柱，沉淀4℃保留。

10.1000×g，10分钟，收集过柱后的液体即为产物。

色谱法是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。目前，根据此原理也有一些商品化的试剂盒出现，代表性产品为Izon公司开发的qEV柱。其优势在于分离时间仅为15分钟，所需要的样本量少，极大程度降低蛋白复合物产生和囊泡聚集的风险，不会破坏外泌体的生物学活性和结构，因此有越来越多的研究者采用该方法分离外泌体。

其操作流程如下：

（1） 当使用qEV柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜。

（2） 柱子的抗菌溶液包含0.05%w/v的叠氮化钠。大量的叠氮化钠有毒，所以应该避免皮肤和眼睛的直接接触。

（3） 废弃缓冲液应妥善处理：叠氮化钠会在铜制管道中累积引起爆炸。生物样品可能有危险，当使用qEV柱时，请教实验室安全员有关样品安全操作的要点。

柱子保存在含有抑菌剂（例如20%乙醇，或<0.05%w/v的叠氮化钠）的溶液中，存放于4~8℃。抑菌剂可以在冲洗步骤时引入。使用前如下图4-3所示：将柱子固定，使液面水平（确保柱子垂直），不要移除底部滑动盖，小心缓慢地移去顶盖。

（1） 移除底部滑动盖，并且使用至少10ml洗脱缓冲液（PBS）冲洗柱子。如果不是使用PBS洗脱，那么至少使用30ml洗脱缓冲液冲洗柱子。记下5ml缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子。

（2） 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

（3） 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

（4） 使用当天新配的过滤（0.2μm）缓冲液避免引入颗粒物污染。

（1） 在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

（2） 加入 500μl样品。

（3） 立即移去底部滑动盖。

（4） 立即开始收集0.5ml馏分；最开始的六个馏分（3.0ml）是空隙体积，不包含囊泡，通常无需分析。建议将空隙体积收集在同一个收集管中来节约时间，并可避免6个单独的管子带来的测量误差。

（5） 当最后的样品刚刚进入柱子顶部筛板（与之相平），加入更多的缓冲液，但是不要高于顶部筛板2ml。等待直到最后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释。

（6） 空隙体积之后立即收集3个囊泡馏分，每个馏分500μl（馏分7、8和9）。测量每个馏分的EV浓度（使用IzonqNano）和蛋白纯度。为了得到高浓度囊泡，使用最高EV浓度的馏分（通常7和8）。注意：合并馏分会稀释EV浓度。为了得到高纯度囊泡，使用最低蛋白浓度的馏分。

（7） 当收集完囊泡馏分之后，用至少10ml缓冲液冲洗柱子，并按照要求保存柱子。记下5ml缓冲液通过排阻柱所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。

由于外泌体是一个大小为几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。

胡国文等报道的旋转超滤法分离外泌体流程如下：

1.将收集到的细胞上清液约100ml分装于2个50ml离心管中，4℃，300×g离心10分钟除去残余细胞。

2.2000×g离心20分钟除去细胞碎片。

3.小心收集上清并用0.22μm孔径过滤器进行过滤。

4.将收集到的上清液加入装有100000NW-CO超滤膜的Model18050旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下。

5.打开磁力搅拌器，使涡漩高度为液体高度的1/3。

6.待上清液超滤完毕后加入50mlPBS并再次超滤，重复3次。

7.超滤完毕后，用0.5mlPBS重悬超滤膜上的外泌体，并转移至1.5ml的Ep管中。-80℃冰箱中保存备用。

不同的外泌体的分离方法，所得到的外泌体的纯度、生物学活性及结构具有差异。目前主要的几种方法的原理和优缺点见表4-2。

由表4-2可知，研究者应该针对实验的需求和实验条件选择合适的分离方法。