第四章　脐带间充质干细胞的外泌体制备及应用

脐带间充质干细胞（umbilical cord mesnchymal stem cell，UCMSC）是一类来源于脐带，具有自我更新和多向分化能力的细胞。脐带间充质干细胞是目前应用前景最广泛的干细胞之一。据报道，脐带间充质干细胞能够治疗多种难治性疾病，已在其他章节中详细描述，此处不再一一赘述。脐带间充质干细胞的治疗潜能，以往认为是由于脐带间充质干细胞归巢并分化以代替损伤部位原有的细胞发挥功能。随后发现，脐带间充质干细胞大部分都停留在肝、脾和肺，到达损伤部位的数量小于1%。在到达靶组织的间充质干细胞大部分几天后消失，只有少量的间充质干细胞长期停留在损伤部位。有研究者用基因命运图谱技术显示再生的细胞来自于模型中存活的固有细胞。这些信息提示间充质干细胞对组织的修复作用可能不由于其分化能力。随后，有报道指出间充质干细胞的条件培养基能模拟MSC修复组织的功能。提示间充质干细胞可能是通过分泌营养因子以内分泌和（或）旁分泌的方式促进组织修复。直到2010年Lai等分离了间充质干细胞分泌的外泌体，并首次证明间充质干细胞来源的外泌体起到损伤修复作用。本章将围绕脐带间充质干细胞来源的外泌体的生物学特性和功能，制备和标准化，最新进展和运用前景进行介绍。

外泌体（exosome，Exo）是活细胞分泌的直径为30~150nm的双层膜性囊泡，外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙和体液中（包括血液、唾液、尿液和母乳）。外泌体属于胞外囊泡类型，除了外泌体之外，细胞还分泌微泡以及其他的膜囊泡，膜囊泡的直径较外泌体更大，是150nm~1μm。外泌体的密度为1.10~1.21g/ml，具有来源细胞的胞质和胞膜成分，内含多种蛋白质、RNA和脂质等。外泌体的功能主要是：细胞间通信（信号传递），细胞内“垃圾”清理以及参与免疫应答等。此外，外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大的功能区别。

目前为止，间充质干细胞（mesnchymal stem cell，MSC）被证明是产生外泌体能力最强的细胞。MSC来源的外泌体（MSC-exo）的产生机制和其他细胞来源的外泌体一致都是通过核内体途径。外泌体在核内体系统中的形成包括位于细胞膜周围早期核内体（early endosome，EE）的形成和位于细胞核周围晚期核内体（late endosome，LE）的成熟，晚期核内体也称多泡体（multivesicular body，MVB）。早期核内体形成后，其界膜向内出芽，吞没一部分胞质成分伴跨膜蛋白及膜周蛋白内陷，形成含有一些囊泡的次级核内体（也叫作晚期核内体或者多泡体）。这个过程依赖于转运必须内体分选复合物（ESCRT）的作用，ESCRT系统包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ共4个蛋白复合物（图4-1）。主要过程包括ESCRT-0结合到早期核内体的质膜表面，并通过其泛素化结合位点与早期核内体中的特异性物质结合，再通过位于结合位点上游的ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ作用向内形成出芽小泡，最后在ESCRT-Ⅲ的剪切作用下与核内体膜分离。这4个蛋白复合物相继发生作用，最后召集并与衔接蛋白Alix连接，促进囊泡出芽。膜上的同线蛋白和蛋白多糖也发挥着重要作用，Alix与同线蛋白结合，而蛋白多糖与CD63结合。抑制ESCRT、同线蛋白、Alix以及蛋白多糖都能导致外泌体的分泌减少。晚期核内体行程中可以分选包裹不同蛋白、miRNA、mRNA和lncRNA，而形成后有两种命运。一是与溶酶体结合，将内容物降解，二是与细胞膜结合，将囊泡以外泌体的形式释放到胞外。目前，外泌体内容物的选择机制尚不清楚，除了ESCRT依赖途径，有研究提出外泌体的产生也依赖于4次跨膜蛋白和神经酰胺，认为MSC-exo来源于MSC质膜中产生内吞作用的脂筏区。外泌体的释放主要由Rab家族蛋白调节，其中Rab27a和Rab27b是主要的调节子；其次，Rab35和Rab11通过与10A-C结合也能调节其分泌。

MSC-exo的悬浮密度为1.10~1.18g/ml，其膜表面富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺脂筏脂质及信号蛋白，外泌体内含有多种蛋白质和RNA。这些生物活性物质的种类和数量并不是始终相同，而是随着细胞的生理状态的变化而改变。

MSC-exo包含大多数外泌体共同表达的物质，包括跨膜蛋白和融合蛋白（GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白）、4 次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、多泡体生成相关蛋白（Alix、TSG101）、脂质相关蛋白和磷脂酶。除此之外，MSC-exo还含有MSC表达的黏附分子，包括CD29、CD44和CD73等。目前发现，MSC-exo一共含有857种蛋白质，但并非全部同时表达。在3组独立实验中，通过高精度质谱分析，检测到MSC-exo分别含有379、432、420种蛋白质，其中只有154种蛋白质共同表达。而本课题组通过超高速离心法分离MSC-exo外泌体和PEG沉淀法分离MSC-exo，并用高精度质谱检测，分别检出169和102种蛋白质。可见MSC-exo所含蛋白质的种类和丰度受到多种因素的影响，包括外泌体的分离方法、外泌体的保存手段、外泌体蛋白的检测方法、细胞的生理生化状态等。因此，MSC-exo蛋白质的种类和丰度仍需进一步研究和分类。但就目前研究资料可知，MSC-exo所含蛋白质充分代表了32种生物过程，包括外泌体生成和免疫。在这些蛋白质中，与治疗作用相关的可能包括表面受体（PDGFRB、EGFR、PLAUR）、信号分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13/GNA12、CDC42和 VAV2）、黏附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素、LGALS1/LGALS3）和MSC相关表面抗原。其中，蛋白酶体20S核心颗粒的7条α和7条β链MSC-exo都有表达，且免疫蛋白酶体中的3个亚基表达水平较高，提示MSC-exo损伤修复功能可能与此有关。

MSC-exo含有的RNA大多是核酸数目小于300的小RNA（small RNA），其中包括microRNA（简称miRNA）。通过微阵列杂交技术对比MSC和MSC-exo中的miRNA发现，在166种miRNA中有15种只存在于MSC-exo中，106种只存在于MSC中，33种在两者中都表达，而有12种miRNA在MSC-exo的表达是MSC的2倍。MSC-exo不含28S和18S核糖体，但含有其降解产物miRNA923。MSC-exo中miRNA主要以前体（pre-miRNA）的形式存在，与MSC细胞相比，其pre-miRNA/miRNA比率更高，能被RNaseⅢ剪切成成熟的miRNA。这些数据提示我们，MSC-exo并非随机而是选择性的包裹MSC细胞内的小RNA，包括miRNA、非编码RNA或者RNA降解的中间产物，而不倾向于包裹完整的mRNA或者核糖体RNA。